[工学]基因工程第2章 酶学基础2DNA连接酶.pptVIP

第二章 基因工程的酶学基础 第二节 DNA连接酶 2.1 DNA连接酶的发现(P21) 1967年，世界上有数个实验室几乎同时发现了一种能够催化在2条DNA链之间形成磷酸二酯键的酶，即DNA连接酶(ligase)。 这种酶需要在一条DNA链的3’-末端具有一个游离的羟基(-OH)，和在另一条DNA链的5’-末端具有一个磷酸基团(-P)，只有在这种情况下，才能发挥其连接DNA分子的功能作用。 2.2 DNA连接酶的基本性质 修复双链DNA上切口处的磷酸二酯键 修复与RNA链结合的DNA链上切口处的磷酸二酯键 连接多个平头双链DNA分子 2.3 分类（P21） 2.4 DNA连接酶的反应体系 连接酶连接切口DNA的最佳反应温度是37℃。但是在这个温度下，黏性末端之间的氢键结合是不稳定的。因此，连接黏性末端的最佳温度，应是界于酶作用速率和末端结合速率之间，一般认为4~15℃比较合适。 平末端的连接采用T4DNA聚合酶，可在较高的温度进行，如22 ℃。 2.5 体外连接DNA片段的方式（P130-135） 同种内切酶产生的黏性末端的连接 同尾酶产生的黏性末端的连接 不同黏性末端的连接 2.5.1同种内切酶产生的黏性末端的连接 2.5.2同尾酶产生的黏性末端的连接 2.5.3不同黏性末端的连接 2.5.4平末端的直接连接 从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的黏性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多 提高平头末端连接效率的方法包括： 加大连接酶用量（10倍于黏性末端的连接） 加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会 加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用 加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM 2.5.4平末端的连接 （1）直接用T4DNA连接酶连接； （2）先用末端核苷酸转移酶，给平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA连接酶进行连接； （3）用连杆连接平末端DNA分子； （4）DNA接头连接法。 直接用T4DNA连接酶连接平末端 2.5.5末端修饰后的连接 DNA片段末端同聚物加尾后连接（用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）给具平末端的DNA片段加上poly(dA)、 poly(dT)、 poly(dC)、 poly(dG)尾巴之后，再用DNA连接酶将它们连接起来） P133 黏性末端修饰成平末端后再连接 DNA片段末端同聚物加尾后连接 黏性末端修饰成平末端后再连接 2.5.6 加上连杆后再连接(P133) 如果重组体DNA是用平末端连接或是用同聚物加尾构建的，那么很可能无法用原来的限制酶作特异的切割，因此也不能获得插入DNA片段。为了解决这个问题，可采用连杆法提供必要的序列，进行DNA分子的连接。 所谓连杆(1inker)，是指用化学方法合成的一段由10～12个核苷酸组成的、具有一个或数个限制酶识别位点的寡核苷酸片段。 DNA片段末端加上化学合成的连杆，能形成黏性末端，连接后可用内切酶进行切割。 连杆的5’-末端和待克隆的DNA片段5’-末端，用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后再通过T4DNA连接酶的作用使两者连接起来。接着用适当的限制酶消化具有连杆的DNA分子和克隆载体分子，这样的结果使二者都产生出了彼此互补的黏性末端。于是便可以按照常规的黏性末端连接法，将待克隆的DNA片段同载体分子连接起来。 DNA连杆连接法尽管有诸多方面的优越性，但也有一个明显的缺点，那就是如果待克隆的DNA片段或基因的内部，也含有与所加的连杆相同的限制位点，这样在酶切消化连杆产生黏性末端的同时，也就会把克隆基因切成不同的片段，从而为后继的亚克隆及其它操作造成麻烦。 当然，在遇到这种情况时，一个方法可改用其它类型的连杆，另一种公认的较好的替代办法是改用DNA接头(adapter)连接法。 2.5.7 DNA接头(adapter)连接法 (P134) 于1978年由康乃尔大学吴瑞教授发明的。它是一类由人工合成的一头具有某种限制性内切酶粘末端，另一头为平末端的特殊的双链寡核苷酸片段。当它的平末端与平末端的外源DNA片段连接之后，便会使后者成为具黏性末端的新的DNA分子，而易于连接重组。 小结：平末端DNA片段的连接 （1）直接用T4DNA连接酶连接； （2）先用末端核苷酸转移酶，给平末端DNA分子加上同聚物尾巴之后再用DNA连接酶进行连接； （3）用连杆连接平末端DNA分子； （4）DNA接头连接法。 PCR产物的连接（P135） PCR扩增后的产物往往需要克隆到载体中，传统的PCR产物与载体的连接方法： PCR引物设计时引入载体上的酶切位点，PCR产物经双酶切后定向克隆到目的载体上。 这种方法的优点是定向连接克隆