[工学]酶工程第3章兰州大学酶工程酶的分离纯化.ppt

第三章 酶的分离纯化 大规模提取纯化的特殊性 胞外酶的提取 一、提取 酶活性保护剂 1．化学方法提取 （1）碱提取 （2）溶菌酶和EDTA提取 （2）溶菌酶和EDTA提取 （3）去垢剂提取 离子型去垢剂 Tween 20 （4）渗透冲击 2．物理方法提取 （1）超声波 超声波破碎细胞的原理 （2）固体剪切 固体剪切举例 （3）液体剪切 （4）研磨或搅拌 （5）突然降压法 爆炸式降压法 影响突然降压法破碎效果的因素 3．提取液 （1）盐溶液 盐提取液举例 （2）酸溶液 （3）碱溶液 （4）有机溶剂 4．影响酶提取的主要因素 （1）溶解度 （2）温度 （3）pH值 （5）材料的破碎程度 二、分离纯化 酶分离纯化的目的 1．沉淀法 （1）盐析法 盐析法的操作 盐析法举例 （2）有机溶剂沉淀 （4）PEG沉淀 热处理沉淀杂蛋白 2．透析与超滤 （1）透析 （2）超滤 微孔超滤膜 各向异性扩散膜 极化层 蛋白质的超滤特性 析滤 3．冰冻干燥 4．液—液双水相抽提 液—液双水相抽提的原理 原理（续） 原理（续） 双水相的相图 相图的说明 相图的说明 影响相图的因素 各种双水相系统 酶在两相中的分配系数 收率的计算公式 双水相抽提的应用特点 双水相抽提的应用特点 双水相连续抽提 5．凝胶层析 凝胶层析原理 凝胶层析的原理 凝胶层析柱的再生 交联葡聚糖柱层析洗脱曲线 凝胶层析的分配系数 利用凝胶层析测定蛋白质的分子量 凝胶层析介质的型号 凝胶层析介质的型号 Sephadex的型号和特性 Sepharose的型号与特性 6．离子交换层析 离子交换层析分离蛋白质的原理 离子交换层析分离蛋白质的原理 蛋白质的离子交换性质 离子交换剂衬质的种类 离子交换树脂 离子交换纤维素 离子交换Sephadex 离子交换Sepharose和Trisacryl 离子交换剂的再生 “批式”离子交换 “批式”法的优缺点 7．疏水层析 疏水层析的原理 疏水层析介质 影响疏水作用的因素 不同离子对疏水相互作用的影响 疏水层析的上样和洗脱条件 疏水层析的优点 8 羟基磷灰石层析 羟基磷灰石层析的上样与洗脱条件 羟基磷灰石柱层析洗脱曲线 羟基磷灰石层析效果举例 前述方法的总结 9．亲和层析 亲和层析的原理 亲和层析的过程 载体 琼脂糖和交联琼脂糖凝胶载体 配基 特异配基 通用配基 亲和层析中常用的配基 配基与酶的亲和力 手臂(或称连杆) 偶联方法 溴化氰活化法的反应式 溴化氰活化后与酶的偶联 洗 脱 10．染料配基层析 染料配基层析的优点 染料配基层析的应用范围 染料配基层析的应用范围 染料配基的种类 Cibacron Blue F3G-A结构式 Procion Red H2-B结构式 酶与染料配基之间的作用 酶与染料配基之间的作用 染料配基层析的条件 染料配基层析的注意事项 pH对鼠肌肉丙酮酸激酶与Procion Red HE3B-Sepharose结合力的影响 染料配基层析的注意事项 染料配基层析的注意事项 柱层析装置图 11. 几种新型层析方法 径向流动层析柱 B. 灌注层析 灌注层析介质 灌注层析的特点 C. 膜层析 膜层析的特点 多级膜层析 12．电泳 凝胶电泳 等电聚焦 双向电泳 13．结晶法 蛋白质结晶的原理 蛋白质结晶的原理 影响蛋白质溶解度的因素 有机溶剂结晶法 有机溶剂结晶法 盐析法 盐析法 14. 提纯方法的选择和顺序 酶纯化过程的效果 纯度标准 酶贮存中的稳定性 0.4 6.7 19.7 23.1 44.2 每毫升凝胶结合 丙酮酸激酶的活性 （u） 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 pH b. 金属离子 少量的二价阳离子，尤其是Mg2+，可明显地影响染料配基与某些酶的结合力。应用Matrex gel Red A 柱层析纯化兔肌丙酮酸激酶、酵母己糖激酶、磷酸甘油激酶或兔肌激酶时，若缓冲液中含有10mmol/L MgCl2，除兔肌激酶外其它三种酶与介质间的结合力明显增加。其它的二价阳离子如Ca2+、Mn2+ 等及某些一价阳离子如K+、Na+ 等也有类似的作用。故可用金属离子调节和改变染料配基层析的选择性。在洗脱时若由于金属离子的存在而吸附过强时，可在洗脱液中加入低浓度的EDTA消除此影响。 c. 洗脱条件 可用含适当浓度氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化铵、硫酸铵、甘油、乙二醇、尿素、硫氰酸钠或Triton X-100的缓冲液进行非特异性的洗脱，也可用含有底物、辅酶，或另外一些特异性的可溶性配基如NAD(P)+、NAD(P)H、ATP、ADP、CoA、FMN、Blue A、Red A等作特异性的洗脱。特异性洗脱可使染料配基层析的分离效果进一步提高。 径向流动层析法为上世纪80年代后期才发展起来的一种新的色谱分离技术。径向流动层析