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酶学及酶工程 Enzymology and Enzyme Engineering 第二章 酶的性质及制备 第一节 酶的性质及活性测定 酶的性质：物化性质 1. 溶解性 影响溶解性的最主要因素：酶分子表面电荷。 调节酶溶解性的方法： 1）改变离子强度。盐溶：一定浓度的盐使盐离子吸附在酶表面，增加表面电荷，促进与溶剂分子作用，提高溶解度。盐析：进一步增加盐浓度则使水浓度降低，酶表面水化作用减弱，造成相互聚集而沉淀。这个性质被用于酶的提取及提纯。 2）改变酸碱性。酶表面正负电荷相等时，为等电点，酶分子之间的斥力最小，易于聚集而沉淀，溶解度最小。改变酸碱性将改变表面电荷状况，从而改变酶的溶解性。 3）改变温度。溶解度和温度相关，但过高温造成酶变性而沉淀。 4）改变溶剂介电常数。加入有机溶剂使酶分子静电作用加强而沉淀。常用甲、乙醇，聚乙二醇等。 物化性质 2. 紫外吸收光谱 侧链中的芳香基团（首先是色氨酸，酪氨酸；其次是苯丙氨酸）在280nm附近位置有较强的紫外光吸收，形成蛋白质在该位置的紫外光谱吸收峰。峰的细节位置及强度由这些侧链在蛋白分子表面的含量及微环境决定。经常用于测定蛋白的浓度（纯蛋白）和在蛋白质纯化过程中进监测。也被用于监测蛋白的构象变化。 A＝εcl ε:摩尔消光系数，c: 浓度，l: 光径 物化性质 3. 空间结构的稳定性 有活性的酶的空间结构稳定性有限。不同的酶可能有不同的稳定性。 保持稳定性的环境因素： 1）离子强度适当； 2）最适酸碱度左右； 3）低温； 4）加入稳定剂：甘油，糖类，聚乙二醇等。 物化性质 4. 化学反应性 1）水解：酸水解，碱水解，蛋白酶水解。 2）氧化：侧链的巯基易被氧化，甚至可被溶于水中的溶解氧所氧化。如巯基是必需基团，会使酶失活。另外氧化会形成二硫键，影响酶的空间结构。保护的方法：真空除氧；加入保护剂，如巯基乙醇，二巯基苏糖醇（DTT）。 3）侧链基团被化学作用：除巯基很易被作用外，羟基，氨基，胍基，羧基，咪唑基，苯基等均可被特定试剂作用。化学修饰的基础。 酶学性质：催化反应速度 酶学性质 酶学性质 影响酶反应速度的因素：3）离子强度 随着离子强度增加酶分子表面电荷减少。 影响：酶分子的整体构象； 酶活性部位的电荷以及构象。 一般离子强度过高和过低都会降低酶反应速度，但不像酸碱度对速度的影响那样可以用定量公式表示。 酶学性质 催化活性的可调节性： 1）辅助因子对活性的影响； 2）化学修饰对活性的影响：激活和抑制； 3）别构作用调节活性：正协同和负协同。 动力学特征：饱和动力学。 反应速度和作用物浓度非直线关系，而是双曲线关系。存在最大反应速度，受酶浓度制约，呈饱和状态。 V～[S]曲线可分为一级区，过渡区和O级区。 酶反应为饱和动力学 酶学性质 稳态前是一段很短的时间过程，通常酶反应的稳态前约不到1秒。达到稳态时ES的生成速度和分解速度相等，ES浓度不变，反应速度不变。但稳态不是平衡态，反应物和产物的浓度都在变。 酶活性测定的是稳态时的反应速度，也称为酶反应的初速度。 酶的活性测定 主要实验方法之一：连续监测法 分光光度法和荧光法。 利用酶反应底物和产物在某特定波长下有较大差异的光吸收或荧光发射进行连续监测其变化。根据其变化计算底物或产物的浓度变化，进而计算单位时间内底物被作用 或产物产生的量，即酶反应的速度。 分光光度计（图）是分光光度法的测定仪器。 根据光源分为紫外（氘灯，200-350nm）和可见（卤钨灯，330-900nm）。 带有恒温装置是测酶活用分光光度计的特定要求。测活前要先行仪器恒温和样品恒温。 测酶活的分光光度计要有连续监测装置，通常为记录仪或电脑。 测活时要调好仪器：温度，波长，监测的范围、速度，记录仪的笔位等。非自动的分光光度计还要调好光源。 利用底物和产物在特定波长的光吸收差别 分光光度计原理 荧光分光光度计 荧光分光光度计和普通分光光度计的区别在于接收的不是通过比色杯的透射光，而是在90°位置上接收比色杯中荧光化合物被激发的荧光。 荧光计用的比色杯为四面透明的，普通分光光度计的比色杯则是二面透明的。 荧光比透射光更微弱，因此荧光计通常很灵敏，对溶液的要求也更高。通常用荧光法测活的溶液需要超滤去除小悬浮颗粒，以排除散射光干扰。 由于分子间的遮挡效应，底物的浓度不能过高。 使用比色杯要特别注意保护透光面，用后注意及时清洗。 比色杯 酶反应在比色杯中进行，将反应系统加入比色杯恒温，通常是最后加入酶溶液启动反应，混匀后即启动连续监测。也有最后加某一底物启动反应的。 按材料比色杯有石英、玻璃和塑料的。