正常人与肺结核病人rhil-2扩增的cd3cd56nkt细胞生物学活性的比较分析-comparative analysis of biological activities of cd 3cd56 nkt cells amplified by rhil - 2 between normal people and pulmonary tuberculosis patients.docx

正常人与肺结核病人rhIL-2扩增的CD3+CD56+NKT细胞生物学活性的比较研究中文摘要研究背景：ΝΚΤ(naturalkillerT)细胞是一群细胞表面既有T细胞受体(TCR)，又有NK细胞受体的特殊T细胞亚群。该群细胞具有抗感染，抗肿瘤，免疫调节等多重功能。虽然共表达T细胞受体和NK细胞受体可以作为NKT细胞的表型指标，但是NKT细胞是一个复杂的异质性群体，其确切的定义仍未取得一致意见。已经有研究发现CD3+CD56+NKT细胞是细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-inducedkiller，CIK)中的主要效应细胞，其含量的多少与CIK的细胞毒活性的高低有关。目前CIK过继免疫治疗肿瘤的方法在临床已得到应用，但是针对结核病的细胞过继免疫疗法还很少研究。由于结核病的致病菌结核杆菌是一种胞内寄生菌，机体对它的消灭也依赖细胞免疫，所以有关结核病的细胞过继免疫疗法的研究有望成为攻克结核病的一个全新的领域。目的：从活化规律、细胞数量、表型和分泌细胞因子四方面比较正常人与肺结核病人新鲜外周血中CD3+CD56+NKT细胞的差异；分别观察正常人与肺结核病人PBMC(peripheralbloodmononuclearcells)用rhIL-2刺激后CD3+CD56+NKT细胞的增殖规律，再从细胞数量、表型和分泌细胞因子三方面比较正常人与肺结核病人rhIL-2扩增后的CD3+CD56+NKT细胞的差异，以期为探讨肺结核病的发病机制和治疗方法开辟一个新的道路。方法：1.淋巴细胞各亚群的检测方法：正常人与肺结核病人外周静脉血收集于肝素钠抗凝的真空采血管内，于4小时内完成流式抗体染色处理过程，利用流式细胞仪获取数据并分析结果，最终得出淋巴细胞各亚群的数值。2.活化指标CD69的检测方法：密度梯度离心法获取外周血单个核细胞(PBMC)，用rhIL-2刺激PBMC，分别于刺激后0、8、16、40和64小时检测NK细胞和NKT细胞表面CD69的表达情况。3.rhIL-2扩增NKT细胞的方法：密度梯度离心法获取外周血单个核细胞本论文研究受安徽省教育厅高校省级重点实验室重点科研项目(2004sys008)资助(PBMC)，加入rhIL-2刺激培养人外周血单个核细胞(PBMC)，以后每2-3天补充rhIL-2和新鲜RPMI1640完全培养液继续培养细胞两周，分别于培养第0、6、10和14天检测NKT细胞比例并计数。4.NKT细胞的表型和胞内细胞因子检测：于培养第0天和第14天收集细胞，流式细胞仪检测NKT细胞的表面分子γδTCR、CD4、CD8和CD161的表达情况以及胞内细胞因子IFN-γ、IL-4、TNF-α和IL-17的分泌量。结果:1.肺结核病人(n=42)与正常人(n=30)相比，NKT细胞和Th细胞比例未发生显著变化，NK细胞比例显著增加(P0.05)，Th/Tc比值显著增加(P0.01)，而T细胞、γδT细胞、Tc细胞和B细胞都显著降低(P0.01)。2.PBMC经rhIL-2刺激0h、8h、16h、40h和64h后，正常人NK细胞和NKT细胞表面CD69表达量均显著增加（与0h比较，P0.01）。肺结核病人NK细胞和NKT细胞表面CD69表达量也显著增加（与0h比较，P0.01）。肺结核病人组与正常组比较，NK细胞表面CD69表达量除0h无显著差异（P0.05），其余各时间点表达量均高于正常组（P0.01、P0.01、P0.05、P0.05）；NKT细胞表面CD69表达量除64h无显著差异（P0.05），其余各时间点表达量均高于正常组（P0.01、P0.05、P0.05、P0.01）。3.正常人PBMC在rhIL-2刺激培养14天后，细胞总数由（0.86±0.18）×106扩增到（38.28±4.56）×106（P0.01），细胞扩增了45.79±7.77倍；NKT细胞绝对数则由（5.57±5.16）×104扩增到（1475.05±868.98）×104（P0.01），细胞扩增了246.26±134.06倍；NKT细胞相对比例由（5.14±2.11）%扩增到（38.57±21.95）%（P0.01）。结核病人外周血单个核细胞在rhIL-2刺激下也会显著扩增，细胞总数由（0.95±0.19）×106扩增到（18.15±1.73）×106（P0.01），细胞扩增了19.77±4.82倍；NKT细胞绝对数由（3.44±1.20）×104扩增到（323.23±75.98）×104（P0.01），细胞扩增了108.69±59.22倍；NKT细胞相对比例由（3.67±1.25）%扩增到（17.67±3.23）%（P0.01）。两组比较，肺结核病人NKT细胞扩增效率显著低于正常人。4.正常人外周血中NKT细胞高表达CD8，扩增后的NKT细胞则