甲硫氨酸脑啡肽对移植静脉再狭窄作用用机制.docVIP

甲硫氨酸脑啡肽对移植静脉再狭窄作用用机制 　　【中图分类号】 R654 【文献标识码】 A 【文章编号】1185-1672(2007)-04-0299-04 　　摘要 目的 通过建立大鼠静脉自体静脉移植模型，应用甲硫氨酸脑啡肽（M－Enk）及其长效受体拮抗剂盐酸纳曲酮（NTX）观察M－Enk对内膜增殖的影响，并初步揭示其中的作用机制。方法 建立M－Enk、NTX及对照组三组大鼠自体静脉移植模型，并分别给药；于不同时期取移植静脉标本，做形态学观察、c-fos、c-myc免疫组化染色、Western blot半定量检测，最后对数据采用方差分析及q检验。结果 1. M－Enk组内膜厚度各时段较对照组明显降低，NTX组内膜厚度各时段较对照组明显增加；2. M－Enk组移植1～3天c-fos蛋白表达较对照组明显受到抑制，NTX组移植1～3天c-fos蛋白表达较对照组明显升高；3. M－Enk组移植1～2周c-myc蛋白表达较对照组明显受到抑制， NTX组移植后3天至2周，c-myc蛋白表达较对照组明显升高；4. Western blot结果与免疫组化结果基本相符。结论 血管移植后，创伤破坏了内源性M－Enk与其受体结合的自分泌环，诱发了c-fos、c-myc等早反应基因的表达，从而引起更多的迟反应基因的表达，最终形成血管内膜的增生。 　　关键词 甲硫氨酸脑啡肽；自体静脉移植；c-fos、c-myc基因；血管内膜增生 　　 　　1 材料和方法 　　1.1 材料 　　1.1.1 主要试剂 M－Enk（美国Sigma公司）；NTX（美国Sigma公司）；c-fos免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程公司）；c-myc免疫组化试剂盒（武汉博士德生物工程公司）。 　　1.1.2 主要仪器凝胶自动成像分析系统1D Kodak (UVP美国Bio-Rad公司)；SXB－1型手术显微镜（中国上海10×）；计算机图象分析仪（Real Time Image Analyzer,Luzex-F,日本）；250克左右，3个月龄Wistar大鼠90只，雌雄不拘（由中国医科大学动物实验中心提供）。 　　 　　2实验方法 　　2.1 动物模型制作给药方法及标本收集 大鼠90只，随机分成3组，每组30只。按文献方法［1］，行颈静脉移植。术后分别向3组每天腹腔内注射：第一组M－Enk（10mg/kg）；第二组NTX（30mg/kg）；第三天生理盐水（0.2ml）做对照组。术后分别于1，3，7，14，28天取移植静脉，分为均等两份，一份常规甲醛固定，石蜡包埋；另一份-70℃保存?? 　　2.2 标本检测 　　2.2.1 组织学染色 行HE染色，光镜观察，计算机图象分析仪分析血管内膜厚度，每60度测量一次该处内膜厚度，共6处，计算平均厚度。评估移植静脉内膜增生程度。 　　2.2.2 c-fos、c-myc免疫组化染色 石蜡标本作5μm血管横断面连续切片。应用c-fos及c-myc兔抗鼠多克隆抗体（工作浓度1：100），免疫组化染色采用SABC法染色、DAB显色。结果判定：在光学显微镜下观察，组织切片中显示胞核染为棕黄色或褐黄色者为阳性细胞标志。400倍光镜下随机计数5个视野内细胞总数中有多少是染色阳性细胞，以阳性细胞为分子计算c-fos蛋白表达指数，并用阳性率（％）表示。 　　2.2.3 Western blot 按参考文献［2］的方法操作，凝胶成像分析系统上摄像分析吸光度值。 　　2.3 统计学处理 每组数据以?x[TX-]±s?表示。所有数据在SPSS11.0下进行处理，差异显著性采用方差分析及q检验。P＜0.05有统计学意义。 　　 　　3 实验结果 　　3.1 组织学染色结果 对照组移植后1天，可见内皮细胞脱落，管壁内有炎性细胞浸润。术后7天，可见新生内膜，VSMCs处于增殖和混乱状态。术后14天，移植血管出现显著增生的内膜，与术后7天相比差异显著（P＜0.05）。术后28天，血管内腔面基本完成内皮化，内膜增生更显著，与术后7天相比有显著性差异，内有大量VSMCs。M－Enk组内膜7天时较对照组减少了32％，14天减少了26％，28天减少了18％，与对照组相比，有显著性差异。NTX组内膜厚度与对照组相比7天增加了28％，14天增加了27％，28天增加了13％，与对照组相比，有显著性差异。 　　3.2 c-fos免疫组化染色结果 在光学显微镜下观察，c-fos基因蛋白定位于细胞核，组织切片中显示胞核为棕黄色或棕褐色为阳性细胞。对照组移植后1天，移植血管出现c-fos蛋白阳性表达达到高峰，阳性细胞百分比达11％，阳性细胞多靠近血管腔。移植后3天，c-fos表达有所下降，移植后1周，c-fos阳性细胞比例明显下降，与移植后1天相比，有