操纵滚环扩增反应检测端粒酶活性及单核苷酸多态性.pdfVIP

摘  要  摘 要 基因组包含着生物体的遗传信息，基因可以通过复制把遗传信息传递给下一代，同 时将遗传信息表达出来。基因突变与遗传性疾病密切相关，基因突变的检测对于当前基 因组学的研究及临床诊断等具有重要意义。论文主要以滚环扩增（RCA ）反应为基础， 结合磁性分离、分子荧光和共振光散射等技术建立了端粒酶活性及单核苷酸多态性 （SNP）检测的新方法。 利用支化滚环扩增反应（BRCA ）建立了检测端粒酶活性的新方法。根据端粒酶反 转录酶的作用，在生物素标记的端粒相关序列的 3 ′端进行重复序列延伸；设计短链引 物与延伸产物完全互补，利用链酶亲和素与生物素特异性结合作用，使用链酶亲和素修 饰的磁珠分离延伸产物，然后进行热变性和磁分离，获得与延伸产物杂交的引物，再以 BRCA 反应将引物扩增。加入荧光染料 SYBR Green I 测定扩增产物的荧光信号，可达 到检测端粒酶活性的目的。利用该方法能从 20000 个肺癌细胞中检测出端粒酶活性。 基于支化滚环扩增反应的原理，结合共振光散射技术，建立了SNP检测的新方法。 突变型DNA与锁式探针两端完全匹配，可在连接酶的作用下将锁式探针连接成环，引发 BRCA反应，产生含有上千个重复序列的长链DNA产物，而野生型DNA与锁式探针的 3′ 端存在一个碱基错配，不能将其连接成环，因而不能进行BRCA反应。当将BRCA产物 加入到强酸介质（HClO ）中时，核酸变性聚集成大粒子，产生增强的共振光散射，据 4 此建立了滚环扩增均相无标记共振光散射检测SNP的新方法。根据BRCA产物产生的散 射光信号差异，可以灵敏地分辨 1 pmol/L突变型和野生型DNA ，实现了 1%突变频率的 特异性检测。 关键词 滚环扩增 端粒酶活性 单核苷酸多态性 I Abstract Abstract Genome is the carrier of genetic information for organisms. Genetic information can be passed on to the next generation and be expressed by gene duplication. Gene mutation is closely related to the genetic diseases, so detecting genetic mutation is significant to the current genomic research and clinical diagnosis. Combining rolling circle amplification reaction with magnetic separation, fluorescence and resonance light scattering techniques, we established new methods for the detection of telomerase activity and single nucleotide polymorphism (SNP). In this paper, we have established a new method to detect the telomerase activity based on Branched Rolling Circle Amplification (BRCA). Telomerase, as a kind of reverse transcriptase, can extend biotinylated telom