核酸的电、磁纯化新方法及其在微流控芯片中的运用研究.pdfVIP

摘 要 摘要 微全分析系统(u．TAS)具备在芯片实验室上实现分析过程集成化、自动化 和缩微化的特点，熊够极大地减少试剂的消耗量、缩短分析时闯、提高分析检 测效率。因此，在疾病诊断、生化分析、临床检测等领域获得了普遍关注。通 过不周功能芯片的使用，达到分析全过程多种功能的集成，是实现微全分析系 统集成他的有效途径之一。针对复杂生化样品体系，样品预处理是实现整个鼙 ．TAS分析的前提，而目前样品预处理技术正成为lI．TAS向集成化、高效率、 连续化发展必须突破的瓶颈之～。 在基因分析和疾病检测中，常常需要进行DNA提取、DNA扩增和DNA分 离检测等步骤，其中DNA的提取是决定基因分析成败与质量的关键步骤。传 统的核酸提取方法具有操作繁琐，难以自动化等缺点。固液双相分离富集是一 种既可实现待测物的浓缩富集又能够去除杂质组分干扰的样品预处理技术，而 且它比较容易与微流控芯片系统结合实现在线预处理。 本论文发展了两种可用于捕获浓缩生物样品中DNA的固液双相分离富集 方法一电渗析分离富集与磁珠法国相萃取，并把两种方法集成至微流控芯片 中，实现生物样品的在线预处理，芯片易与其他芯片联用。论文共分为四章。 第一章为绪论，首先总结了DNA提取的～般过程与几种传统的DNA提取 方法；然后介绍了膜分离技术尤其是电渗析技术及其在生物分离领域的应用； 接着概述了磁性复合纳米颗粒的制备方法及其在DNA萃取中的应用；最后， 论述膜分离技术与固相萃取技术在样品预处理微流控芯片中的集成和应用。 第二章构建一个可用于浓缩生物大分子(DNA)的电渗析装置。基于电渗析 技术，利用阳离子交换膜在电场中对负电性物质的截留特性，在流路死体积中 捕获并浓缩负电性物质。以阴性染料达旦黄作为探讨富集概理麴模型化合物， 研究了负电性物质在装置中的运动特点，并初步优化实验条件。生物大分子样 品的实验结果表明：本装置在低电压条件下成功地实现无损伤捕获浓缩DNA 分子，单体系的天一D融实验回收率约47％，浓缩液可直接用予PCR实验；装置 具备较好的分离效能：从DNA一血红蛋白的混合体系中选择性地捕获浓缩DNA， 揍 要 去除绝大部分的蛋白质，浓缩液可直接用于PCR实验；从全血破碎液中成功地 萃取出基因组DNA，：次浓缩液可阕予PCR实验。本电渗析装置适用于分离具 备不同电性的生物大分子，如等电点不同的蛋白质或核酸，实验操作自动简便， 使用简单的有机试剂：也可用于一般的无机离予和生物小分子的纯化与预寓集 以降低瓣仪器的检测限要求；微型化可与微流控芯片联用或集成于芯片上，在 生物样品的捕获、脱盐和分离等预处理过程中有很大的应用空间。 第三章发展了可控表面电性的超顺磁氨基化SiOz@Fe304复合纳米颗粒 纳米颗粒；基于硅烷试剂的永解，利用3一氨焉基三乙氧基硅烷积阿醛)对S童02@ 研究磁珠的表面电性，发现氨基化磁珠的表面电性对溶液的州敏感，通过研究磁 珠在萃取DNA体系中的电性，提出磁珠与DNA分子结合的机理。利用该磁珠成功地 从全血中萃取得到基因组DNA，实验仅使用简单的、不对PCR产生干扰和抑制的试 剂，萃取效率约700,6，洗提液可直接用于PCR试验。本磁珠除了具有超顺磁性、分 散性好等优点之外，其表面电性可通过调节溶液的p}{得到控制、磁珠与DNA分 子作用时，吸附和脱附速率快。这些优势使其成为一种良好的固定相，在DNA 萃取等生物分离过程、在样品预处理芯片中具有广阔的应用前景。 第四章制作了两个基于固液双相分离富集技术的样品预处理芯片。其一把 第二章基于电渗析技术的装置微型化并集成至微流控芯片中。以PMMA为材料， 用激光刻蚀沟道，制作一个“三明治”式的分离浓缩芯片，阳离子膜依靠机械 力固定予两层芯片间。在线观测达筐黄在芯片上的富集特性；以花菁类染料 系DNA与D凇一血红蛋囱混合体系研究芯片的浓缩和分离效能，结采表明：该芯 片能够无损伤地捕获浓缩单体系与混合物体系中的DNA，浓缩液可直接供给PCR 试验；在全血中基因组的提取实验中，该芯片能够捕获浓缩裂解液中的基因组 DNA，但是纯度较低。芯片窦动纯糕度高，试莉用量少等特点使具有与其他芯片 联用的潜力，如与PCR芯片联用，用于分离PCR产物中的蛋囱质；或与其他萃 摘 要 取芯片联用用于提取液的脱盐，浓缩等处理