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聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction) PCR技术: 概念:通过模拟体内DNA复制的方式,在体外选择性地将DNA某个特殊区域扩增出来的技术。 广泛用于分子生物学和基因工程及其它与DNA鉴定相关的领域,如疾病检测、临床应用、商品检疫、法医鉴定、新药品的开发等。 PCR技术产生的历史背景 1971年,Khorana等人就提出了利用PCR在体外扩增DNA的概念; Saiki(1985)和Mullis(1986)两家研究室分别用改进的Kleppe法获得了大量染色体DNA单拷贝基因; 1988年,Chien从水生栖热菌(Thermus aquaticus)中分离出耐热DNA聚合酶,简称Taq DNA聚合酶; Mullis正式确定了体外扩增DNA技术,1987年获得专利,命名为Polymerase Chain Reaction (PCR)。 PCR反应的基本过程 PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成: ①变性(denaturation) 将模板DNA置于92~96℃处理,使dsDNA链解开成为ssDNA,以便它与引物结合. PCR反应的基本过程 ②退火(annealing) 模板DNA经加热变性成单链后,温度降至55℃左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合成局部双链; PCR反应的基本过程 ③延伸 DNA模板--引物结合物在Taq DNA聚合酶的催化作用下,以dNTP为反应原料,按碱基配对与半保留复制原理,引物沿5’→3’方向延伸,最终合成一条新的与模板DNA链互补的DNA链。 PCR反应的基本要素 模板DNA Taq酶 dNTP 引物 Mg2+ Template DNA 模板DNA的数量与纯度,是PCR成败与否的关键环节之一。但不同类型PCR反应对模板DNA数量与纯度的要求不同。 数量:3×106个拷贝 酵母菌 10ng 细菌 1ng 质粒 1pg 纯度:RAPD OD260/OD280=1.6~1.9 AFLP OD260/OD280=1.7~1.8 DNA Polymerase Taq DNA Polymerase 来源:古细菌嗜热水生菌(thermus aquaticus) 特点: ①耐高温,在70℃下反应2 h后其残留活性大于90%,在95℃下反应2 h后为40%; ②在热变性时不会被钝化,不必在每次扩增反应后再加新酶; ③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率,增加了扩增长度(2.0 kb); ④具有5’→3’外切酶活性,但无3’→5’外切酶活性,因而对某些单核苷酸错配无校正功能。 pfu DNA Polymerase 来源:是从Pyrococcus furiosis 中精制而成的高保真耐高温DNA聚合酶。 特点: ①它不具有5’→3’外切酶活性,但具有3’→5’外切酶活性,因而可纠正PCR 过程中产生的错误,使产物的碱基错配率极低; ②PCR产物为平端,无3’端突出的单A核苷酸,不能进行T-A克隆。 Vent DNA Polymerase 来源:从嗜热高温球菌(Thermococcus Litoralis)中分离出的。 特点: ①不具有5’→3’外切酶活性,但具有3’→5’外切酶活性,可以去除3’错配的碱基,具有校对功能; ②PCR产物为平端,无3’端突出的单A核苷酸,不能进行T-A克隆; ③PCR产物的扩增长度可达10kb以上。 Primers(引物) 引物:在PCR反应中与待扩增的靶DNA区段两翼互补的寡聚核苷酸,其本质是单链DNA片段。 primers 随机引物:引物为随机设计的短序列,通常为10bp左右,扩增产物的非特异性高,易受扩增条件影响; 特异引物:引物根据特定的DNA序列设计而成,扩增产物的特异性强; 简并引物:是根据密码子的简并性原则,以蛋白质序列中的氨基酸保守区反向设计而成的,扩增产物的特异性比较强。 InsuF 5-AATCAGCACCTATGTGGTTCTCAYYTNGTNGA-3’ InsuR 5-GCTGGTACAGAGAGCAGATGGAAKYRCARCAYTG-3 其中 Y= C/T N= A/T/C/G K= G/T
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