Ch05 基因在大肠杆菌、酵母中的高效表达-part two课件.pptVIP

5.2.1 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征 5.2.1.2 酵母菌表达外源基因的优势 基因表达调控机理清楚，遗传操作简便 具有真核蛋白翻译后加工系统 大规模发酵技术成熟、工艺简单、成本低廉 能将外源基因表达产物分泌至培养基中 不含有特异性的病毒、不产内毒素 酵母菌是最简单的真核模式生物 5.2.2 酵母菌的宿主系统 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 减少泛素依赖型蛋白降解作用的突变宿主菌 4.2.3 酵母菌的载体系统 4.2.4 酵母菌的转化系统 酵母菌的转化程序 转化质粒在酵母细胞中的特点 用于转化子筛选的标记基因 4.2.4.1 酵母菌的转化程序 (1) 酵母菌原生质体转化法 早期酵母菌的转化都采用在等渗缓冲液中稳定的原生质体转化法 原生质体转化法的一个显著特点是：一个受体细胞可同时接纳多个质粒分子 4.2.5 酵母菌的表达系统 4.2.6.1 乙型肝炎病毒的结构与性质 病毒颗粒的主要结构蛋白是病毒的表面抗原多肽（HBsAg）或S多肽 颗粒内的蛋白成份包括核心抗原（ HBcAg ）、病毒DNA聚合酶、微量病毒蛋白 4.2.6.2 产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母 目前，由酿酒酵母生产的重组HBsAg颗粒已作为乙肝疫苗商品化，重组产物的最终产量可达细胞总蛋白量的1%-2%。 产乙肝表面抗原的重组酿酒酵母 乙型肝炎病毒的结构与性质 产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母 4.2.6 利用重组酵母生产乙肝疫苗 乙型肝炎病毒的包装蛋白编码基因 ATG ATG ATG TAA 108 aa 55 aa 226 aa preS1 preS2 S S 多肽 226 aa M 多肽 281 aa L 多肽 399 aa 乙肝病毒在体外细胞培养基中并不能繁殖，因此第一代的乙肝疫苗是从病毒携带者的肝细胞质膜上提取出来的。 虽然这种质膜来源的疫苗具有较高的免疫原性，但由于原材料的限制难以大规模产业化。 传统乙肝疫苗的制备 4.2.6.3 产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母 由于巴斯德毕赤酵母染色体DNA上还拥有第二个乙醇氧化酶基因AOX2，所以整合型重组菌仍能在含有甲醇的培养基上生长。 重组菌首先在含有甘油的培养基中培养，待甘油耗尽后，加入甲醇诱导HBsAg表达，最终S蛋白的产量可达细胞可溶性蛋白总量的3%在大规模的生产过程中，巴斯德毕赤酵母工程菌在一个240L的发酵罐中培养，最终可获得90克22nm的HBsAg颗粒，足够制成900万份乙肝疫苗。 5.2 酵母基因工程（自学） 5.2.1.1 酵母菌的分类学特征 酵母菌（Yeast）是一群以芽殖或裂殖方式进行无性繁殖的单细 胞真核生物，分属于子囊菌纲（子囊酵母菌）、担子菌纲（担子酵母 菌）、半知菌类（半知酵母菌），共由56个属和500多个种组成。如 果说大肠杆菌是外源基因最成熟的原核生物表达系统，则酵母菌是最 成熟的真核生物表达系统。 5.2.2.1 广泛用于外源基因表达的酵母宿主菌 目前已广泛用于外源基因表达和研究的酵母菌包括： 酵母属 如酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 克鲁维酵母属 如乳酸克鲁维酵母（Kluyveromyces lactis） 毕赤酵母属 如巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris） 裂殖酵母属 如非洲酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe） 汉逊酵母属 如多态汉逊酵母（Hansenula polymorpha） 4.2.2.2 提高重组蛋白表达产率的突变宿主菌 ssc1 改善重组蛋白分泌 钙离子依赖型的ATP酶 ssc2 提高重组蛋白表达 转录后加工 rgr1 提高重组蛋白表达 转录水平 ose1 提高重组蛋白表达 转录水平 ssc11 改善重组蛋白分泌 羧肽酶Y rho- 提高重组蛋白表达 转录水平 突变类型 生物效应 作用位点 4.2.2.3 抑制超糖基化作用的突变宿主菌 能抑制超糖基化的突变类型 mnn 甘露糖生物合成缺陷型 alg 天门冬酰胺侧链糖基化缺陷型 och 外侧糖链添加缺陷型 突变类型 生物效应 许多真核生物的蛋白质在其天门冬酰胺侧链上接有寡糖基团， 它们常