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医学分子遗传学 第四章分子遗传技术方法 基因表达分析技术METHODS FOR ANALYZING GENE EXPRESSIONSpeaker：genemRNAProtein polypeptide chainGene Expression一、实时荧光定量PCR （real time quantitative PCR，RT-qPCR）实时荧光定量PCR (real time quantitative PCR，RT-qPCR)是荧光化学物质与PCR产物相结合，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。荧光定量实时PCR与普通PCR的比较?在线实时监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控，能够实时地观察到产物的增加，直观地看到反应的对数期? 降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了PCR反应的特异性? 增加定量的精确性 全程监控，精确定量? 结果分析更快捷方便，无需电泳 非特异性荧光染料标记：SYBR Green I 特异性荧光标记：TaqMan优点与特异性的荧光探针相比价格便宜 只需要设计PCR引物荧光信号强与其它探针相比设计简单可用于多通道检测 可用于SNP的检测缺点由于它和模板的结合是非特异性的，它可以和所有的双链DNA包括引物和非特异性扩增产物结合，不能真实反映目 的基因的扩增情况比DNA结合染料价格高Ct（ threshold value ）值是指荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数，此时荧光信号明显高于背景荧光信号。Ct值与模板起始浓度的关系 模板起始浓度越高，Ct值越小 Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系 如果模板浓度增加1倍，Ct值就提前1个循环到达 如果模板浓度减少1倍，Ct值就滞后1个循环到达相对定量（Relative quantification）是计算要处理样本相对于正常（内参基因）样本的基因表达量变化，属于倍数关系式，扩增效率达到100%时用2 -??CT 法来分析处理实验数据。实验过程中还要引入一个或多个内参基因进行校正和标准化。内参基因（Reference gene）是指在不同类型细胞、不同实验处理条件下恒定表达的一类管家基因，常用的内参基因有b-actin、GAPDH、18sRNA、efla等。相对定量分析方法12 -ΔΔCt前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100％且偏差在5％以内。靶基因AGAPDHΔCt对照组实验组1．计算ΔCt：ΔCt=Ct 靶基因－Ct GAPDH，分别计算实验组和对照组的ΔCt。2．计算ΔΔCt：ΔΔCt=ΔCt实验组－ΔCt对照组。3．计算相对表达量的差值。2 －ΔΔCt 相对定量分析方法2：双标准曲线法前提：目标基因与内参基因扩增效率不同 待测样品目的基因浓度 待测样品内参基因浓度 F=对照样品目的基因浓度 对照样品内参基因浓度二、基因表达分析的具体步骤1、提取RNA,并鉴定所提RNA的完整性（0.8%的琼脂糖凝胶电泳）和纯度（紫外分光光度计（2.0-2.2））。2、反转录3、设计引物（1）、NCBI 官网 gene bank 查找xx基因cDNA序列，根据cDNA序列设计RT-qPCR引物，产物长度80-150bp最佳。引物由primer 5软件设计，正反引物的Tm 值相差小于2，GC%比小于3。（2）、设计好的引物再通过NCBI blast 引物比对官网进行初步筛选，并将设计好的引物交由相关基因公司（如华大基因）合成。（3）、新合成的引物以cDNA 为模板，添加gene star PCR mix 进行预实验，设计多个实验重复，ABI梯度PCR仪上进行梯度PCR扩增，产物进行琼脂糖凝胶电泳，marker 比对结果判定产物大小及引物退火温度的最佳条件。（4）、将ABI 梯度PCR 仪在最佳退火条件下扩增的PCR产物交由相关基因公司（如华大基因）进行普通测序，用于判断测序结果与目标片段是否吻合，引物位置与初始引物设计位置是否相同。4、内参筛选根据实验样品类型及条件，选取相关基因（如GAPDH 、?-actin等）为备选内参基因，geNorm 软件分析备选内参在实验样本中的稳定性，以M1.5为最佳内参。5、确定目的基因和内参基因的扩增效率 及定量PCR数据处理方法根据绝对定量PCR原理，对cDNA进行5个数量级的10倍梯度稀释，利用各个浓度的cDNA进行绝对定量以获得相关基因的扩增效率。6、实时荧光定量PCR (real time quantitative PCR，RT-qPCR)反应体系反应体系体积SYBR Green I Master Mix10ulForward Primer(10umol/L)1ulReverse Primer(10umol/L