慢病毒载体PPT.pptVIP

病毒载体和慢病毒载体 基因转移载体是基因治疗的重要组成部分,包括病毒载体和非病毒载体。目前应用的病毒载体主要有逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、单纯疱疹病毒载体等。不同的病毒载体各有利弊。随着对病毒载体的不断改造完善,提高其基因转移效率和安全性,病毒载体将在基因治疗中继续发挥重要作用 逆转录病毒只能转导分裂期细胞,腺病毒载体在体内不能实现目的基因稳定的长期表达,且反复应用容易引起免疫反应。来源于人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的慢病毒载体由于可以感染非分裂期细胞、容纳外源性目的基因片段大、免疫反应小等特点越来越受到人们的重视 逆转录病毒载体、腺病毒载体： 1.逆转录病毒(retrovirus vectors ,RV)载体 逆转录病毒载体基因转移系统包括两部分:一部分是用外源基因替换病毒结构基因的逆转录病毒载体;另一部分是包装细胞的基因组DNA中整合了逆转录病毒结构基因 将水泡性口炎病毒糖蛋白(VSV-G)整合于逆转录病毒包膜中能加速各种宿主细胞对其进行膜融合和内吞,具有广泛的宿主范围和更高的转染效率,可高效的转染静止细胞,并能抵抗血清补体灭活的作用。 王烈. 基因治疗病毒载体的研究进展[J]. 医学综述, 2007, 13(7): 490-492. 2.腺病毒(adenovirus, AV)载体 腺病毒是一种二十面体病毒壳体大分子，基因组是一个线性的双链DNA，其5’端与一种末端蛋白（TP）共价结合，5’端上还具有末端反向重复序列（ITRs）。它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外，不整合进入宿主细胞基因组中。 目前，最主流的腺病毒载体系统有Adeasy系统（ 通过原核重组极大提高了腺病毒的重组效率）和AdMax系统（改造后的真核腺病毒包装体系，进一步增加的操作的便捷，同时滴度较Adeasy有进一步提高）。 第四代腺病毒仅含有反向末端重复序列(ITRs)和包装信号,载体容量达37kb,进一步降低了免疫原性,被称为“高容量”载体。AV载体具有宿主范围广、基因转移效率高、对非分裂细胞也有感染性、比较容易制备和操作、理化性质稳定、遗传毒性较低及比较安全等优点。 3.腺相关病毒(adeno-associated virus,AVV)载体 腺病毒相关病毒(AAV)是一种缺陷型的单链DNA病毒,只有在辅助病毒如腺病毒、单纯疱疹病毒、痘苗病毒等存在的情况下,才能进行最佳复制,产生新的病毒颗粒,否则只能进行潜伏感染。AAV载体既可以转染分裂细胞又可以转染非分裂细胞,在宿主体内以定向整合的方式存在,70%以上的整合位点位于第19号染色体q13.3-qter区,且对人体无致病性 4.单纯疱疹病毒(herpes simplex virus,HSV)载体 单纯疱疹病毒是一种双链DNA病毒,作为基因治疗载体， HSV载体非常适用于需要基因长时间表达的基因治疗,但在介导肿瘤基因治疗等要求基因短暂高水平表达的基因转移是不合适。 5.慢病毒(lentivirus)载体 在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞和一些较难转染的细胞， 如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，而且大大增加目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。 在体外实验及体内实验的研究中，慢病毒 己经成为表达外源基因或外源shRNA的常用载体形式之一。 P.s shRNA是short hairpin RNA 的缩写。翻译为“短发夹RNA。 shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环（loop）序列分隔的，组成发夹结构，由polⅢ启动子控制。随后再连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。在活体中输送“小干扰RNA”（siRNA）的一种办法是，将siRNA序列作为“短发夹”克隆进质粒载体中。当送入动物体内时，该发夹序列被表达出来，形成一个“双链RNA”（shRNA），并被RNAi通道处理 辅助成分 辅助成分包括： 慢病毒包装质粒和可产生病毒颗粒的细胞系。 慢病毒包装质粒可提供所有的转录、包装、重组的假病毒颗粒所需要的所有辅助蛋白。 为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。