第五章 动物细胞融合与单克隆抗体技术PPT.pptVIP

4.HAT选择性培养基的筛选 融合后细胞混合液 HAT培养基 2 weeks later HT培养基 正常培养基 1 week later 杂交瘤细胞的筛选 ： 脾细胞 (B淋巴细胞) 骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞 脾细胞/?脾细胞 骨髓瘤细胞/ ?骨髓瘤细胞 骨髓瘤细胞 脾细胞 筛选出 不能长期存活 不能长期存活 5.阳性杂交瘤细胞的筛选（抗体的检测） 常用方法： 要求： 简便、快速、敏感; 在短时间内能检测大量样品 酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 间接免疫荧光法(Indirect immunofluorescence, IFA) 放射免疫法(radioimmunoassay, RIA) 双相扩散法 酶联免疫吸附法(ELISA) 抗原 第1抗体 酶 第2抗体 待检杂交瘤培养上清液 底物 有色产物 酶标仪检测 技术原理： 6.杂交瘤细胞的克隆培养 常用克隆化方法： 有限稀释法 软琼脂平板法 显微操作法 1个细胞/96孔 饲养细胞(feeder cells) ELISA法检测单克隆杂交瘤细胞的培养上清，选出分泌特异性抗体的阳性孔，所分泌抗体即为单克隆抗体。 7. 杂交瘤细胞的冻存与复苏 目的：保种 方法：离心收集杂交瘤细胞悬液，用含10％DMSO和10％FBS的培养基调整细胞密度，若短期保存，可置-80度冰盒中；若长期保存，则从冰盒转入液氮中。 复苏：如果冻存的细胞是来自96孔板的一孔，复苏后也应接种到96孔板的一个孔中 8.单克隆抗体的规模化生产 主要有两种方法 （1）体外法：用人工反应器大量培养杂交瘤细胞 （2）体内法：用生物体作为细胞反应器大规模培养杂交瘤细胞 转瓶培养 微载体培养 9.融合后杂交瘤不生长的原因分析： 聚乙二醇有毒 小牛血清的质量有问题； 支原体污染 HAT有问题 第五章 动物细胞融合与杂交 5.1 细胞融合与杂交 一、概念 细胞融合：两个或两个以上相同的细胞合并形成一个细胞的过程。 细胞杂交：两个或两个以上不同的细胞合并形成一个细胞的过程，包括种内杂交和种间杂交。 二、原理 异核体阶段 杂种细胞形成 同核体 异核体 合核体 关键是膜的融合： 两个亲本细胞并列，细胞膜接触 膜组织局部破坏 形成包围融合细胞的连续胞膜 细胞融合过程可分为： 凝集：细胞凝集与细胞膜的糖蛋白有关 蛋白质分子重新分布：是细胞融合的必要前提 脂质分子重排：是实现细胞融合的关键 胞质合并：后续的稳定步骤。 2.化学融合剂诱导融合（P107） （1）化学融合剂的种类 三、细胞融合方法 （2）PEG诱导的原理  （3）PEG诱导的特点 sp3杂化，有孤对电子，可与H2O形成H键而具有强烈的吸水性。 3.电融合技术 三、细胞融合方法 电融合的特点 ①融合频率高，对细胞伤害小 ②正弦交变电场对细胞的长时间作用会损伤细胞 ③非特异性融合 三、细胞融合方法 磁-电融合 声-电融合 电-机械融合 细胞化学聚集融合 生物素-抗生物素- 抗原-抗体桥联 4. 激光诱导细胞融合 （1）原理： 光镊所形成的光学势阱会把细胞拉向光束中心，钳住细胞，从而实现了对生物粒子的远距离、非接触式捕获。 （2）特点： 可对单个核细胞进行操作，但设备昂贵，操作技术要求高。 三、细胞融合方法 5. 微流控芯片的细胞融合技术 （1）原理： 将微通道网络整合到生物芯片上，使得微流控系统成为细胞融合的理想平台 （2）特点： 实现大量单个成对细胞的融合 （二）细胞融合的方法 6.细胞融合的影响因素 细胞的种类和性质 细胞表面性质 细胞种类 亲本细胞的亲缘关系 融合温度及PH等环境条件 离子强度及离子种类 三、细胞融合方法 四、 融合子检出的选择系统 遗传互补选择 营养缺陷型互补选择 抗性互补选择 形态特征互补选择 生长特性选择 遗传互补选择-HAT培养基筛选 H, 次黄嘌呤; A, 氨基喋呤; T, 胸腺嘧啶 DNA 内源性途径(主要途径) 谷氨酰胺 or 单磷酸尿苷酸 四氢叶酸 A H T 外源性途径(旁路途径) (Hypoxanthine guznine phosphoribosyl transferase) 次嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 ( HGPRT ) 胸腺嘧啶激酶 ( TK ) (Thymidine kinase) B淋巴细胞： HGPRT+， TK+ 骨髓瘤细胞： HGPRT-， TK- 短期存活，最终死亡 死亡 外源性途径(旁路途径