荧光PCR原理和污染处理PPT.ppt

* 深圳匹基生物股份公司技术支持部 荧光定量PCR检测原理 和污染的处理 主讲人：卫明 主讲单位：深圳匹基生物股份有限公司 第一部分荧光PCR技术的原理、特点和定量方法 深圳匹基生物股份公司技术支持部 荧光标记信号的产生 荧光标记基团在某波长的激发光刺激下，产生一个更长波长的发射光 深圳匹基生物股份公司技术支持部 FRET某荧光标记基团在激发光刺激下生成某波长的发射光，当另一屏蔽基团与其距离合适时，原发射光将会被屏蔽基团所吸收，并转化为其他波长的发射光或热能，称之为FRET。 深圳匹基生物股份公司技术支持部 TaqMan荧光探针的原理 PCR扩增体系中加入一个特异性的寡核苷酸荧光探针，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 深圳匹基生物股份公司技术支持部 阳性标本扩增曲线 阴性标本扩增曲线 典型的荧光PCR扩增曲线 深圳匹基生物股份公司技术支持部 荧光阈值（threshold ）：荧光本底 设定PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光阈值的默认设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 Ct值C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数（如下图所示）。 与结果分析相关的两个重要名词：荧光阈值与Ct值 深圳匹基生物股份公司技术支持部 Ct值的确定样本PCR扩增曲线与阈值线交叉点的扩增循环数 深圳匹基生物股份公司技术支持部 PCR荧光试剂标准品扩增曲线 （仪器：Bio-rad iCycler） 1x108 拷贝/ml 1x107 拷贝/ml 1x106 拷贝/ml 1x105 拷贝/ml 1x104 拷贝/ml 深圳匹基生物股份公司技术支持部 定量原理和方法 原理：每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。 外标法：将几个已知拷贝数的纯化的目的基因标准品进行FQ-PCR 扩增，绘制荧光定量标准曲线。 内标法：将已知浓度的内标基因加到各标本中，与标本一起经历核酸提取、加样、逆转录、PCR扩增及信号检测的全过程，比较内标最后的实测值与已知值，以检验标本中是否存在抑制PCR的因素，也可对样品的拷贝数加以校正。 深圳匹基生物股份公司技术支持部 荧光PCR定量的原理-外标法 深圳匹基生物股份公司技术支持部 未知样本拷贝数的确定 第二部分 PCR污染及预防对策 深圳匹基生物股份公司技术支持部 污染原因 标本间交叉污染 PCR试剂的污染 PCR扩增产物污染 气溶胶污染 实验室中克隆质粒的污染 深圳匹基生物股份公司技术支持部 临床基因扩增实验室的规范化建设 合理的实验室分区 试剂贮存和准备区 标本制备区 扩增区 扩增产物分析区（全自动仪器可以不设此区）严格单一行进路线，严格的清洁次序 深圳匹基生物股份公司技术支持部 规范化的管理和标准操作程序（SOP） 仪器设备的维护保养程序 仪器设备的校准程序 仪器设备的操作程序 临床标本的处理程序 临床标本的保存程序 核酸产物分析检测程序等 深圳匹基生物股份公司技术支持部 PCR防污染措施 1.实验环境的控制PCR应实行严格的分区操作：前准备区；样本处理区，其中DNA和RNA的处理也应该分开；扩增区。各区专区使用，并尽量使用一次性消耗品，高压消毒，实验器械和台面均应进行定期消毒等。 2．避免PCR后处理荧光PCR不同于其他的PCR方法，无须对PCR扩增产物进行任何的检测，实际就是对PCR污染的有力预防。 3．dUTP防污染系统反应体系中常规的dNTPS中的dTTP替换为dUTP，在扩增过程中dU取代dT的位置掺入到PCR产物中，在尿嘧啶糖基酶（UNG）的作用下，发生U的糖苷键的水解，经高温处理后DNA链断裂成碎片，从而无法成为下一轮的PCR的模板。 深圳匹基生物股份公司技术支持部 污染的监测 对照试验 试剂空白对照阳性对照 阴性对照 重复性试验