荧光定量PCR原理及应用PPT.ppt

实时荧光定量PCR原理及应用;实时荧光定量PCR的基本原理;在实时荧光定量 PCR 反应中，引入了一种荧光化学物质，随着 PCR 反应的进行， PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线图 .;;荧光背景信号阶段 ：为扩增最初的10～15个循环，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，我们无法判断产物量的变化。 平台期：扩增产物已不再呈指数级的增加。 PCR 的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的 PCR 产物量不能计算出起始 DNA 拷贝数。 ;荧光阈值：是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。 CT值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 CT 值 。;CT 值与起始模板的关系研究表明，每个模板的 CT 值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多， 到达荧光阈值的CT 值越小，反之越大。;; 定量方法;; 其他定量方法; 荧光定量PCR检测模式;检测模式; 在 PCR 反应体系中，加入过量 SYBR 荧光染料， SYBR 荧光染料特异性地掺入 DNA 双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的 SYBR 染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与 PCR 产物的增加完全同步。 SYBR Green I 工作原理;;水解探针模式（Taqman）;一分子的产物生成就伴随着一分子荧光信号的产生，随着循环数增加，荧光信号不断积累。;分子信标探针模式;模板不存在时形成茎环结构，荧光基团和淬灭基团紧紧靠近而被淬灭。当存在模板时，环序列将与模板配对，此时分子信标成链状而非茎环状，荧光基团与淬灭剂分开，使得荧光基团发出荧光。;; 引物设计原则; Taqman探针设计原则;实时荧光定量PCR的应用; 2. 基因表达差异分析:例如比较 经过不同处理样本之间特定基因的表达差异 ( 如药物处理、物理处理、化学处理等 ) ，特定基因在不同时相的表达差异以及 cDNA 芯片或差显结果的确证. 3. 基因分型:例如 SNP 检测，甲基化检测等。 ;