荧光定量PCR技术讲座PPT.ppt

TIANGEN BIOTECH (BEIJING) CO.,LTD;内容概要;实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析; 扩增曲线 荧光阈值 Ct值;Cycle（循环数）;Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数;理想的PCR反应;非理想的PCR反应;在扩增产物达到荧光阈值时，所经历的循环数为Ct;Cycle number;同一个样品重复96次PCR的扩增曲线 ;线性关系、扩增效率确认;;内容概要;非特异性荧光标记 SYBR Green I 特异性荧光标记 TaqMan Probe 分子信标 ;;热 变 性;问题点： SYBR Green I与任何双链DNA进行结合后散发荧光，因 此如果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将 同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。 ;Taqman探针法——原理;Taqman探针法——工作机理;1、引物、探针的设计原则： 探针Tm为68-70℃ ，30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素， 引物尽量靠近探针，扩增片段200 bp，引物Tm为59-60℃ 2、反应参数的设定： 一般为：94 ℃，10-20S 60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高），也可通过温度梯度优化退火温度 3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值 引物浓度：100-900nM 探针浓度：50-300nM 4、其他与常规PCR相同;3’淬灭基团;实时荧光定量PCR的分类－－几种方法的比较;内容概要;荧光定量PCR的解析方法（依据课题要求提前确定）; 绝对定量解析方法;Sample;质粒标准品的制备;; 方 法：从血液中提取病毒DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测 试 剂：TIANGEN公司探针法试剂RealMasterMix（Probe）（目录号：FP203） 标准品：质粒标准品浓度为106、105 、104 、 103 ；2个重复；设阴性空白对照 实验步骤：提取HBV DNA； 设计特异引物； 设计TaqMan探针并标记探针； 荧光定量扩增； 结果分析：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数。;Sample;扩增效率（E）计算 E = 10-1/斜率 －1 = 10-1/-3.29 －1 = 2.01－1 = 1.01 ;未知样品拷贝数的计算; 相对定量解析方法;理论上目的基因表达量分析条件;必须用内对照基因（管家基因）进行校正，进行相对表达量分析。;管家基因 维持细胞基本代谢活动所必须的基因, 如：GAPDH、Actin、18S rRNA等; 双标准曲线法 2 -△△Ct法 (CT值比较法) ; 通过标准曲线对对照样品、待测样品的目的基因及管家基因进行定量，然后根据计算公式求得相对值即为相对表达量。 ;优点：分析简单，实验优化相对简单 缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线 应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一;公式：;实验数据：;内容概要;SYBR法实验流程及注意事项;RNA制备;RT;定量体系配备;反应体系优化;技能要求;?Rotor-gene6000 ;数据分析;内容概要;TIANGEN公司荧光定量产品;谢谢！