荧光定量PCR技术与常见问题分析PPT.ppt

荧光定量PCR技术与常见问题分析;定量PCR是如何工作的;荧光定量PCR是什么;定量PCR是如何工作的?;与传统PCR一样,反应在温度模块里循环进行: 双链DNA模板变性 引物与模板退火 引物延伸?? 新的扩增片段 ; ;PCR; ;为什么要用定量PCR？;1: 重复性好;2: 灵敏度高;3: 动态范围宽;为什么要用定量PCR？;为什么要用定量PCR？;定量PCR的化学原理;支持的化学试剂;;;;Reporter没有 荧光信号 （发射）;;;;;;;;;;Taq酶很特别……;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;SYBR? Green I 化学原理;;;;SYBR? Green I 染料的缺点;使用 熔解曲线Melt curve (Dissociation Curve) 检查反应特异性;Melt curve: 导数图谱;Melt curve的杂峰;多余的峰是如何产生的?;到底用哪一种化学方法呢？;TaqMan?, 还是 . . . SYBR? Green I?;定量PCR的数学原理;怎样获得结果;PCR的动力学曲线和四个阶段;指数扩增期;只有一个扩增期提供高质量的数据;基 线;阈 值;怎么获得结果;怎么获得结果;定量PCR的应用;定量PCR实验设计和流程---绝对定量和相对定量;定量PCR的实验要素;相对定量实验;实验流程;两种相对定量的方法;两种方法的区别;如何选择相对定量的方法;如何选择相对定量的方法;如何选择相对定量的方法;如何选择相对定量的方法;ΔΔCt法;ΔΔCt法;ΔΔCt法;ΔΔCt法结果计算;公式含义;ΔΔCt法计算示例;ΔΔCt法计算示例;ΔΔCt法计算示例;ΔΔCt法计算示例;相对标准曲线法;相对标准曲线法;绝对定量实验;绝对定量实验;绝对定量实验;绝对定量实验;常见问题分析;1.扩增效率为什么达不到100%;2.扩增效率为什么会大于100%;3.实验结果的重复性不好;3.实验结果的重复性不好;3.实验结果的重复性不好;3.实验结果的重复性不好;3.实验结果的重复性不好;3.实验结果的重复性不好;4.其他问题;日常实验中的注意事项; 扩增产物50-200bp，不要超过300bp Ct值17-30之间 扩增效率在90-110%之间 引物的特异性要好，熔解曲线单峰。 内参基因的选择 选择跟目的基因表达量接近的 多个内参（当一个内参基因的表达量不够恒定时） 在不同样本中内参的Ct值不能相差过大;QUESTIONS?;THANK YOU!