荧光定量PCR技术原理与应用PPT.ppt

1、引物、探针的设计： 探针Tm为68-70℃ ，30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素， 引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物Tm为59-60℃ 2、反应参数的确定： 一般为：94 ℃，10-20S 60℃，30-60S （Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高），也可通过温度梯度优化退火温度 3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值 引物浓度：100-900nM 探针浓度：50-300nM 4、其他与常规PCR相同 （2）Taqman探针法——PCR体系的建立 1.?? 标准曲线法的绝对定量 2.?? 标准曲线法的相对定量? 3.?? 比较CT法的相对定量 五、数据分析 PCR曲线 标准曲线 Sample 25 绝对定量的定义 Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品 可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系 根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量 绝对定量解析方法 单标法 一个目的基因 ——即需要确定其量值的核酸序列。 一组标准样本 ——用来生成标准曲线。可以是含有目的基因的质粒、PCR产物、基因组DNA等。 重复反应孔 –——建议每个样本使用三个或更多重复反应，以确保统计显著性。 标记方法的选择——SYBR Green法或探针法均可。 实验结果显示——扩增曲线；标准曲线；融解曲线（探针法不需要）。 绝对定量分析几要素 质粒标准品的制备 PCR 目的基因克隆 质粒提取，OD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用 目的基因 目的基因 目的基因 质粒 目的基因 基因组DNA 拷贝数的计算： 待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×40×稀释倍数 样本分子量=碱基数×324 待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量×6×1014 倍比梯度稀释方法： 1v原液(标准品i) +9v稀释缓冲液，得标准品ii 1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii 1v标准品iii +9v稀释缓冲液，得标准品iv 1v标准品iv +9v稀释缓冲液，得标准品v 质粒标准品稀释方法与拷贝数计算 方 法：从血液中提取病毒DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测 试 剂：TIANGEN公司探针法试剂RealMasterMix（Probe）（目录号：FP203） 标准品：质粒标准品浓度为106、105 、104 、 103 ；2个重复；设阴性空白对照 实验步骤：提取HBV DNA； 设计特异引物； 设计TaqMan探针并标记探针； 荧光定量扩增； 结果分析：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数。 绝对定量实验例—乙肝病人血液中HBV的绝对定量 Sample copies/ml Ct1 Ct2 Mean Ct STD 标准品 5×103 28.18 28.64 28.41 0.16 标准品 5×104 25.25 25.14 25.19 0.04 标准品 5×105 22.11 22.46 22.28 0.12 标准品 5×106 18.63 18.92 18.77 0.10 未知样品 ? 20.56 20.45 20.5 0.05 空白对照 None None 实验数据 绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量 扩增效率（E）计算 E = 10-1/斜率 －1 = 10-1/-3.29 －1 = 2.01－1 = 1.01 标准曲线制作：利用Mean Ct 作图可得到标准曲线 y = -3.29x + 40.33 R2 = 0.9978 绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量 相关系数（R2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。 扩增效率（E）：0.9-1.2, 越接近1，越理想。 未知样品拷贝数的计算 将Ct值带入线性方程： 20.5= -3.29 X + 40.33 QuantityUnknown=10 6.03