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蛋白质分子设计 授课教师： 彭书明 pengsm@ 分子设计 分子设计的提出的背景 1927 年Heitler－London 用量子力学成功讨论氢分子的结构,量子化学迅速发展。 计算技术的革命和计算方法的改善,量子化学的应用范围越来越广,其概念和计算方法逐渐应用到了化学动力学、催化、电化、生物、药物等领域,产生了一个个新的学科分支———微观反应动力学、量子催化、量子电化、量子生物和量子药物等,和光谱学结合,更促使化学及其相邻学科朝着推理化、定理化、微观化的方向发展。 分子设计的定义 20 世纪70 年代,美国麻省理工学院霍恩贝尔教授提出了分子设计。即从分子、电子水平上,通过数据库等大量实验数据,结合现代量子化学方法,通过计算机图形学技术等设计新的分子。 设计的新分子或具有某种特定性能,可以是药物、材料或其他,或是一种概念、一种复合物或具有分子意义的物质(如催化剂等) 。 蛋白质的分子设计 蛋白质分子设计是一门新兴的研究领域，其本身在不断地发展，其内容也在不断地更新。蛋白质的分子设计就是为有目的的蛋白质工程改造提供设计方案。 蛋白质分子设计的目的： 蛋白质工程提供指导信息 探索蛋白质的折叠机理。 蛋白质分子设计的必要性 生产应用的需要： 虽然经过漫长岁月的进化，自然界已经筛选出了数量众多、种类各异的蛋白质，但天然蛋白质只是在自然条件下才能起到最佳功能，在人造条件下往往就不行，例如工业生产中常见的高温高压条件。因而需要对蛋白质进行改造，使其能够在特定条件下起到特定的功能。 蛋白质三维结构知识的必要性 设计目标及解决办法 改变蛋白质的性质，必须改变蛋白质的序列。 Hartley等于1986年完成了一个重要的有关蛋白质重要性质设计目标及解决办法表，该表至今仍有参考价值。 蛋白质分子设计的分类 蛋白质分子设计又可按照改造部位的多寡分为三类： 第一类为“小改”，可通过定位突变或化学修饰来实现； 第二类为“中改”，对来源于不同蛋白的结构域进行拼接组装； 第三类为“大改”，即完全从头设计全新的蛋白质（de novo protein design）。 小改——少数残基的替换 定义： 小改是指对已知结构的蛋白质进行少数几个残基的替换，这是目前蛋白质工程中最为广泛使用的方法。 采用的方法： 主要通过定点突变技术或盒式替换技术有目的改变几个氨基酸残基，借以研究和改善蛋白质的性质和功能。 小改——两个层次 1．已知立体结构基础上所进行的工作，直接将立体结构信息与蛋白质的功能相关联的高层次的设计 2．借助蛋白质一级结构的序列信息及生物化学性质，在未知立体结构的情形下所进行的分子设计工作 本部分只介绍第一种，实际上第一种已经包含第二种，第二种只是在不得已的情况下采取的一种努力。 例一：核糖核酸酶 小改——举例 结构知识：核糖核酸酶含有104个氨基酸残基，该天然酶具有两对二硫键（Cys2-Cys10，Cys6-Cys103）。 小改设计：在不失去酶活性的基础上增加它的稳定性，日本大阪大学蛋白质工程研究所的Satoshi Nishikawa等人尝试在Tyr（酪氨酸）24和Asn（天冬酰氨）84位引入第三个二硫键。 分子设计和理论验证：从该酶晶体结构可以看出这两个残基是远离催化位点的，经过分子动力学计算证明在这两个残基之间有可能形成二硫键，并且不会影响催化位点的结构。并且采用分子力学和分子动力学方法从核糖核酸的复合物晶体结构建立起核糖核酸突变体的模型。 将Tyr24和Asn84两个残基侧链（保留Cβ，Cγ）消除，将Cγ转变为Sγ。P3 然后经过1000轮突变部位能量最小化和2000轮整体能量最小化以及分子动力学模型建立突变体的结构模型，结构模型中没有不合理的键长、键角和二面角。从设计的角度看这个突变是合理的。 方案的实施：通过基因技术得到突变体，实验证明突变体在保持天然酶活性的基础上大幅度提高了酶的热稳定性。 例二： T4噬菌体溶菌酶 小改——举例 结构知识：包含164个氨基酸残基，该酶不存在二硫键，只有Cys54和Cys97两个半胱氨酸。 分子设计：Matthews等人经过仔细比较和最小化计算设计引入3对二硫键，6个半胱氨酸除了Cys97外，其它5个半胱氨酸由Ile3、Ile9、Thr21、Thr142和Leu164突变而来。 结果：得到了全部单个二硫键（3－97，9－164，21－142）以及2个和3个二硫键的突变体。 实验证明 突变体在氧化状态下均比天然蛋白质更稳定； 二硫键的环区越长越稳定； 二硫键对蛋白质的稳定作用具有加合性，即3对二硫键的稳定效应相当于3个二硫键各自对蛋白质的稳定作用的综合。 例二： T4噬菌体溶菌酶 小改——举例 另，Ma