基因工程的酶学基础课件.ppt

第二章 基因工程的酶学基础;本章节内容;本章学习内容;DNA 重组技术的基本工具;细菌;;2. 性质;;;;;限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA进行分解，切成小片断。;细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶识别切割。;;（3）限制与修饰系统相关的三个基因;1973年H.O Smith和D. Nathans提议的命名系统，命名原则如下：;2. 如果酶存在于一种特殊的菌株中，则将该菌株名的第一个字母加在基本名称后，若酶的编码基因位于噬菌体（病毒）或质粒上，则用一个大写字母表示此染色体外遗传成分。;3. 如果一种特殊的菌株内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示该菌株中发现某种酶的先后次序。 如Hind Ⅱ：d菌株中发现的第二个酶;Ⅰ 型限制性内切酶 ;首先由M.Meselson和R.Yuan在1968年从大肠杆菌 B株和 K株分离的。;需ATP、Mg2+和SAM（S-腺苷甲硫氨酸）;首先由H.O. Smith和K.W. Wilcox在1970年从流感嗜血菌中分离出来。;;EcoR I 5’-G?AATTC-3’ 3’-CTTAA?G-5’ Pst I 5’-CTGCA?G-3’ 3’-G?ACGTC-5’ 产生粘性末端;;;;;基因的针线：DNA连接酶;含有几个核苷酸单链的末端。;CTGCAG ;i）不同的DNA双链：;;B 末端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如dA和dT），即同聚物加尾造成人工粘性末端。;[3] 平齐末端（blunt end）;[4] 平齐末端的特点;ⅱ）削除(平)法 利用S1和Bal31等核酸酶将目的基因粘性末端的单链突出部分削去，使其成为平齐末端;不同来源的酶，识别相同的序列，切割方式相同或不同。;Xma I 5’-C?CCGGG -3’ 3’-GGGCC?C-5’ Sma I 5’-CCC?GGG-3’ 3’-GGG?CCC-5’;识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I、Xho Ⅱ等;5’-?GATC----3’ 3’----CTAG?-5’ ;限制性内切酶的识别和酶切活性一般在一定的温度、离子强度、pH等条件下才表现最佳切割能力和位点的专一性。;;② 诱发星号（*）活性的原因;在离它的不对称识别位点一侧的特定距离处切割DNA双链。;（3）Ⅱ型限制性内切酶不具有甲基化功能;（4） II型限制性内切酶对单链DNA的切割;3. Ⅲ类限制性内切酶 ;核酸限制性内切酶的类型???主要特性;;四、限制性内切酶酶解反应条件;2. 酶解过程;① 酶解体系;大部分II 型核酸内切酶需要相似的反应条件：;② 混匀;③反应终止;④ 酶解结果鉴定;酶切后发现除了目的DNA条带外，还有其它条带;3. 限制性内切酶对DNA分子的消化 ;内切酶在DNA上的所有识别位点都被切开;只有有限数量的酶切位点被切开;（4） 几种常用限制酶识别位点;;;;;;;;;;;4. 限制性内切酶酶解反应中的注意事项 ;④ 酶分装成小份，避免反复冻融;DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。;需要合适的底物：底物（DNA）纯度要高.不能含有RNA和蛋白质;也不能含有过高的EDTA。更不能含有酚、氯仿、乙醇、SDS和其他有机试剂。 DNA的浓度不宜过高，高浓度的DNA会使溶液的粘度增加从而抑制酶分子的扩散导致酶切反应不彻底。常为50ul内含1ug DNA。;大肠杆菌一般有两种甲基化酶修饰质粒：;不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37 oC，少数要求40-65 oC。每微克DNA用1～5单位的酶，保温1~2小时。 ;是影响限制酶活性的重要因素;（2）两种或两种以上的酶切割DNA样品;练习题;从细菌DNA环化现象推测，必定存在一种能把两条DNA双链连接到一起的酶。;DNA连接酶:;（1）大肠杆菌连接酶;（1）必须是两条双链DNA;（4）DNA连接酶的反应条件;1. ATP（NAD+)提供激活的AMP。;4. AMP随后从连接酶的赖氨酸?-氨基转移到DNA一 条链的5’端 P 上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。;5. 3’-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二酯键，释放出AMP。;如何连接由限制性内切酶切割形成片断的末端 ？;;;连接酶反应的最佳温度是37?C。;增加插入片段与载体的接触机会，减少同一个分子末端自我连接的现象。;3. 反应温度;六、DNA连接的反应体系;从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创