第八章讲义－DNA文库构建和目基因筛选.pdfVIP

第八章 DNA文库的构建和目的基因的筛选 第一节 概述 基因工程主要是通过人工的方法分离、改造、扩增并表达生物的特定基因，从而深入开 展核酸遗传研究或者获取有价值的基因产物。通常将那些已被或者准备要被分离、改造、扩 增或表达的特定基因或 DNA 片段，称为目的基因。因目的基因片段需插入载体，导入宿主细 胞内复制，所以对宿主细胞 DNA 而言，又称它为外源性基因。目的基因主要是编码蛋白质(酶) 的结构基因，诸如抗逆性相关基因、生物药和保健品相关基因、毒物降解相关基因以及工业 用酶相关基因等。随着生物长期的进化，生物界积累了大量对人类有用的基因。它是大自然 恩赐于人类的宝贵资源，等待人们去开发利用。 目的基因用途很广，主要有以下几个方面： ①研究该基因的全貌与内涵，如详细分析其结构、功能及调控。 ②与正常基因对比，寻找异常基因的异常点，进而探索疾病发生的分子生物学机理及治 疗对策。 ③研究生物种系进化与相关同源性。 ④应用某种基因大量表达，生产所需要的蛋白质或多肽（如胰岛素、干扰素等药物）。 ⑤在农、林、牧、副、渔业中，改造某些目的基因，以改良品种，促进经济发展。 ⑥建立基因疗法院，选用某种正常基因,引入患者体内，对某些先天性遗传疾病进行治疗。 根据研究对象的研究目的不同，目的基因可来自原核细胞或真核细胞。原核生物基因组 较简单，较易获得目的基因。哺乳动物真核细胞基因组庞大复杂，可根据不同的要求选择适 宜方法，从中获得目的基因。要从数以万计的核苷酸序列中挑选出非常小的所感兴趣的目的 基因，是基因工程中的第一个难题。欲想获得某个目的基因，必须对其有所了解，然后根据 目的基因的性质制定分离的方案。 目的基因的制备是基因工程研究和应用的关键内容之一。根据实验需要，待分离的目的 基因可能是一个完整的有功能的基因，除了编码区，还包含转录启动区和终止区序列，或者 是一个完全的操纵子或基因簇，也可能是只具有编码序列的基因区，甚至是只含启动子或终 止子等部件的 DNA 片段。并且如上所述，不同基因组类型的基因级大小、基因组成和基因排 列也各不相同，因此，分离目的基因应采用不同的途径和方法。 随着生物化学、分子遗传学和分子生物学技术的发展，包括基因工程技术本身的进步， 如今已有很多基因被分离出来。目前主要应用化学合成法、目的基因的直接分离法和逆转录 法来分离、获得目的基因。虽然随着 DNA 合成仪的间世和发展及 DNA 序列分析更加快速、准 确，人工合成寡核苷酸用作分子杂交的探针、序列分析的引物及各种用途的接头等在基因工 程中显示出巨大的优势，但人工合成目的基因仍有很大局限性，目的基因的制备主要还是通 过构建基因组 DNA 文库和 cDNA 文库。PCR 技术的问世及其在基因工程中广泛应用，已经大大 地简化了构建和筛选 cDNA 文库的工作，不仅如此，利用 PCR扩增反应还可以从少量已获得的 目的基因制备其大量的拷贝，避免培养和 DNA 纯化等操作中可能产生的失误。此外，新发展 １ 起来的转座子标签法(transposon tagging)、mRNA 差异显示法 (mRNA differential display) 及限制性片段长度多态性(RFLP)探针等技术也已在分子克隆工作中展现出广阔的前景。可以 相信，随着时间的推移，将有更多行之有效的方法不断涌现，目的基因的制备将更加快速、 准确。下面介绍这些方法及近年来新发展的一些技术。 第二节 直接分离法 2.1 限制性核酸内切酶酶切分离法 限制性核酸内切酶酶切分离法适于从简单基因组中分离目的基因。质粒和病毒 DNA 分子 小的只有几千碱基，大的也不超过几十万碱基，编码的基因较小，获得目的基因的方法也比 较简单。 ①对已定序的 DNA 分子，只需用已知识别序列的限制性核酸内切酶进行一次或几次切割， 分离纯化所需 DNA 片段，与适当载体重组后转化受体菌后即可得到目的基因的克隆。 ②对已知目定位的目的基因，只要根据目的基因两侧的已知的限制性核酸内切酶识别位 点，用适当的限制性核酸内切酶切割，一次就可获得目的基因。 ③即使含目的基因的 DNA 分子未定序或无定位，也只须先通过酶切分析，随后再通过部 分酶切，克隆构建一个非常简单的基因组文