荧光原位杂交（FISH）技术.pptVIP

云南省第一人民医院遗传诊断中心 唐新华 荧光原位杂交(FISH)技术 荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一种利用荧光标记已知序列的单链核酸并作为探针，按照碱基互补配对的原则，与待测样本中互补的单链核酸特异性结合，通过荧光显微镜检测样本上杂交荧光的位置，从而将特定的基因在染色体上定位的方法。 20世纪80年代末期在原有放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。 杂交所用的探针分类 一、染色体特异重复序列探针，例如a卫星、卫星III类的探针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位结合紧密，杂交信号强，易于检测。 二、全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得 。 三、特异性位置探针，由一个或几个克隆序列组成。 涂染探针分离 探针的标记 探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。 直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单，但由于不能进行信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。 间接标记是采用生物系标记的dUTP(biotin-dUTP)经过缺口平移法进行标记，杂交之后用藕联的荧光素的抗生物系的抗体进行检测，同时还可以利用几轮抗生物素蛋白—荧光素、生物素化的抗—抗生物素蛋白、抗生物素蛋白—荧光素的处理，将荧光信号进行放大，从而可以检测500bp的片段。  常用的探针类型 CEP- Chromosome Enumerating Probe染色体计数探针- 设计结合于特定染色体中的重复序列的探针，以测定存在的拷贝数。 LSI- Locus Specific Identifier部位特异标识子- 设计结合于特定靶标区域或基因的部位的探针。经常用于检测特定基因或特定区域的序列缺失或扩增。 WCP-Whole Chromosome Painting 全染色体涂染探针。能将24条染色体涂染上特异的颜色。 FISH的应用范围 一、染色体异常综合征（额外小染色体、微缺失或重复等）? 染色体涂染（chromosome painting）? 基因或DNA片段的染色体定位? 标记染色体（白血病、实体肿瘤等）? 分子病理学（组织切片） 二、细胞间期和分裂中期相中的染色体计数 识别和确定染色体易位 单个位点或基因的缺失/扩增 中期分裂相染色体涂片识别某染色体 FISH技术优点 标本多样性：细胞涂片（绒毛、精子、卵裂球PGD等） 脱落细胞收集制片（羊水等）。 客观判断 高灵敏性 高特异性 定量分析、重复性好 在同一标本中同时评价多个基因的改变 DNA的稳定性 需要的主要设备 荧光显微镜 在荧光显微镜下，DNA探针上的荧光基团在一定波长的激发光激发后会发出一定颜色的光线。射入光激发荧光分子，荧光分子随后发出光子，发出的光子具有较长的波长 – 较低的能量荧光标记的探针与其靶标结合后 – 将能检测到荧光信号 水浴箱2台、热台1个，恒温箱1台。（或者只需1台FISH杂交仪）。 FISH杂交仪 荧光显微镜 实验程序 样品染色体DNA变性 探针变性 杂交过夜 洗涤复染 显微观察 实验程序1 样本 收集 __AneuVysion kit主要用于培养后的以及未经培养的羊水 __样本必须按照ACT手册的推荐的方法收集 __样本收集必须要保证最小程度的母体细胞污染 __羊水最小需要量为2-5ml,这个依赖与孕周龄 __从收集羊水细胞到培养之间的间隔尽量要短（最晚不能超过24小时） __注意，样本绝对不能放置冰箱以及冻存 __样本不能接触强酸强碱或者放置过热的环境，因为上述会影响DNA而导致FISH实验的失败。 __血色或者棕色的样本不能用于检测，因为这些样本已经被母体血液污染 实验程序2 未培养羊水细胞的制片及预处理 离心，丢弃上清。胶原蛋白酶或者胰蛋白酶trypsin处理，吹散细胞团。 37℃水浴至少15-20分钟 离心，丢弃上清。 用KCl低渗液37℃水浴中低渗20 mins。 加0.8-2ml的新鲜固定液(3:1 甲醇：冰醋酸)轻轻混匀，离心5 mins 1,000 rpm并用1ml固定液重悬， 将样本存放-20 ℃至要做FISH实验为止。 准备FISH滴片，将细胞悬液直接滴到冷玻片上，标上2个杂交区域，每个区域大概15－25ul。（或者将玻片用冷的固定液浸湿后滴片，然后放置72度水浴干燥）， 将滴好的片子放在2×SSC中，37 ℃ 1小时老化。 将玻片放到新鲜配置的胃蛋白酶溶液37 ℃杂交预处理 13 mins 。 PBS