大鼠海马神经元钠离子通道电流的记录与分析3085369108.ppt

大鼠海马神经元钠离子通道电流的记录与分析 大鼠海马结构 海马结构位于侧脑室下角底内，是种系发生上比较古老而简单的皮质部分，具有一致的组织结构，细胞分层排列，是研究中枢神经系统解剖和生理的可塑性模型。 海马与许多高级神经活动、行为反应以及植物性神经功能有重要关系，一直被视为神经科学研究的模型。海马与学习、记忆关系密切，且对缺血和缺氧、癫痫、衰老、化学损害剂和有害物理辐射等许多致病因素较为敏感。 细胞膜离子通道 细胞膜上存在多种类型的离子通道，主要有电压门控离子通道、配体门控离子通道以及机械门控离子通道等。 本实验主要讨论使用膜片钳放大器测量门控离子通道的方法。在大鼠海马组织细胞膜上存在多种门控离子通道。电压门控钠离子通道，电压门控钾离子通道以及电压门控钙离子通道等 电压门控钠离子通道 电压门控钠离子通道广泛存在于神经、肌肉等可兴奋性细胞膜上，其激活可导致钠离子快速内流，使细胞去极化，产生动作电位的上升相，主要生理功能是产生可传播动作电位。 钠通道在维持细胞兴奋性及正常生理功能上非常重要，而且还是一些药物的作用靶点，如局部麻醉药和I类抗心律失常药，就是分别选择性地阻断神经细胞和心肌细胞的钠通道，达到阻断兴奋性传播和减少细胞兴奋性的作用。 电压门控钾离子通道 钾离子通道是人体内分布最广、种类最多的一种离子通道。电压门控钾离子通道对所有可兴奋细胞的功能是必需的，主要控制动作电位的形状，形成动作电位，调节动作电位的频率，调整静息膜电位，在调节神经递质释放、心率、胰岛素分泌、神经元兴奋性、上皮电解质传导、平滑肌收缩、细胞体积调节等细胞信号转导过程中起着重要作用。 膜片钳技术 膜片钳技术是一种通过微电极与细胞膜之间形成紧密接触的方法，采用电压钳或者电流钳技术对生物膜上离子通道的电活动（尤其是可对单通道电流）进行记录的微电极技术。 膜片钳技术的基本操作过程： 首先在细胞膜表面，给电极间断施加负压，这样在玻璃微电极壁与膜之间就形成了紧密接触，术语叫做高阻封接（Gigaohm Seal），其电阻达109（1G）以上，以使离子不能从玻璃电极尖端与膜之间通过，只能从膜上的离子通道进出。如果轻轻的回撤电极，细胞膜可被撕下一片，能记录着小片膜的跨膜离子电流。如果运气好的话，这片膜上也许只有一个离子通道，可以记录单通道电流。 膜片钳技术的基本记录模式 膜片钳技术共有四种基本记录模式，其他的记录模式都是在此基础上组建发展衍变而来的。这四种记录模式为：细胞贴附记录模式、内面向外记录模式、外面向外记录模式、全细胞记录模式。 前面三种是单通道记录模式。 内面向外记录模式 将电极接触细胞膜，轻轻的给予负压吸引，就形成了细胞贴附记录模式。将电极迅速提起，脱离细胞，因为细胞具有流动性，粘着在电极尖端的细胞膜会自动融合，从而形成一个囊泡。当将电极提出浴液液面而短暂（2S）暴露在空气中，囊泡的外表面会破碎，再次将电极放入浴液，就形成了内面向外记录模式。另外，如果将电极放入低钙溶液中，囊泡的外表面也会破裂，形成内面向外记录模式。 外膜向外记录模式 形成细胞贴附记录模式后，采用继续施加负压或者电击的方法打破细胞膜，就形成了全细胞记录模式。在形成全细胞记录模式后，将电极缓缓提起，逐渐脱离细胞，同样由于细胞具有流动性，粘在电极尖端的细胞膜会自动融合，这样细胞膜外面就朝向电极极端外，形成外膜向外记录模式。 全细胞膜片钳技术 全细胞膜片钳技术可分为电流固定模式和电压固定模式，前者是在固定电流的条件下检测与其相应的膜电位。例如将电流固定在零时，可检测细胞的自然应答（静息膜电位、自发性膜电位振动或自发性动作电位等）。后者是在电位固定的基础上检测钳制电压时的膜电流。 全细胞膜片钳技术示意图及其等效电路图 全细胞跨膜总电流 持电位于-80mV，给予从-70mV至+60mV的阶梯去极化脉冲电压刺激，步幅+10mV，刺激波宽160ms，刺激频率0.5Hz，可记录得到CA3区锥体神经元全细胞跨膜总电流. 从图中可知，全细胞跨膜总电流既有内向电流成分，又有外向电流成分。内向电流主要发生在刺激初期几毫秒，表现为快速激活和快速失活的特性，之后外向电流成分被激活。 内向钠电流的I-V曲线分析 分别在1、3、5、7、9min记录不同时间的钠电流 钠电流随时间变化过程 如图可知，钠电流的峰值在3min以后达到较大的较稳定的值。对I-V曲线进行分析可知，海马神经元钠电流的激活电位阈值为-60mV，在-30 mV时达到电流峰值，在-60mV到-10mV之间电流随电压变化比较明显，在其后电流随电压的变化较小。峰电流大小为-2339.85±1307 nA,翻转电位为54.8±6.1mV 实验总结与展望 本实验介绍了运用PC2C膜片钳放大测量器大鼠海马神经元钠离子通道的方法。然后就测量所得的数据