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实验六 动物肝脏DNA的制备.ppt
实验六 动物肝脏DNA的制备 Ⅰ 动物肝脏DNA的制备 一、目的 了解肝脏组织制备核酸DNA的方法； 弄清DNA制备的过程中，清除RNA和蛋白质的机理 。 二、原理 根据核糖蛋白（RNP）和脱氧核糖蛋白（DNP）在一定浓度电解溶液中溶解度不同，将二者分离。然后用蛋白质变性沉淀剂去除蛋白，并释放出 DNA ，再利用核酸不溶于乙醇的性质将其析出，达到分离提纯DNA的目的。 在0.14mol/L的氯化钠溶液中，RNP溶解度大，而DNP的溶解度却很小；相反，在1 mol/L的氯化钠溶液中， DNP的溶解度却很大，从而使二者获得了分离。核蛋白分离后可用蛋白质变性沉淀剂（氯仿、异戊醇、十二烷基硫酸钠和热酚）去除蛋白质，释放出的DNA用乙醇沉淀，析出核酸。 动物肝脏中含有核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶，因此在提取核酸时，尽量在低温下操作，并要加柠檬酸钠作为金属离子的络合剂。防止Mg 2+、Fe 2+及Co 2+等激活剂，以便降低核酸酶对核酸的水解作用。 三、操作 抽提 取新鲜鸡肝2g，用SC液洗去血液，低温剪碎（在预冷的研钵中操作），加入4ml SC缓冲液, 用玻璃匀浆器匀浆，然后离心(4000r/min)10min,倾出上层RNP层溶液 。向下层溶液中再加入4ml SC缓冲液，震荡混匀后再4000r/min离心10分钟。倒掉上层溶液。 分离 将下层沉淀用10ml SC液冲洗并转入50ml三角锥形瓶中混匀后，加入2ml 5% SDS溶液，混匀，再加入7.5ml 氯仿/异戊醇，边振动边加入1.15gNaCL晶体，充分混匀后振荡30min，然后转入到50ml离心管，于4000r/min离心20min。小心用吸管由上至下吸取上层DNA层溶液于干净小烧杯中。 提纯 加入2倍DNA溶液体积的95%的乙醇，边加入边用玻璃棒沿同个方向缓慢搅动，当成纤维状DNA全部绕在玻璃棒取出，再用95%乙醇2ml冲洗干净，再用5%氨水将其溶解。并用蒸馏水定容到5ml。即为样品溶液。 思考题 1、在核酸提取溶液中，当加入一定浓度SDS、异戊醇和氯仿后，得到三层溶液分别含有哪些主要物质，为什么？ 2、SC缓冲液的组成分是什么，该溶液在制备核酸时有何作用，能否用磷酸盐缓冲液代替？ 3、如何用紫外法判断DNA样品的纯度？ * * 水相 蛋白质层 氯仿层 水相 待测样品编号，放置在冰箱中。 *
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