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实验四 肝脏DNA的粗提取
实 验 四 肝脏DNA的粗提取 实验目的 掌握DNA提取的基本原理 熟悉DNA提取的操作步骤 掌握离心技术 一般过程 破碎细胞 提取核蛋白 DNA核蛋白和RNA核蛋白分离 蛋白和核酸分离 原则 低温：抑制DNA酶的活性 操作柔和：防止DNA断链 DNA分离纯化的原理 DNA或DNP在0.14MNaCl盐溶液中溶解度很低，而RNA则溶于0.14MNaCl盐溶液，利用这一性质可将生物组织中的DNA与RNA分开 DNA在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在的，因此提取脱氧核糖核蛋白复合物-DNP后，必须将其中蛋白去除 其中蛋白质部分可用SDS使之变性除去（同时破坏核酸分解酶）。 进一步纯化则利用氯仿-异戊醇震荡除蛋白，震荡时，蛋白质变性，形成凝胶，并与DNA分开，DNA则留在水层中。 利用DNA不溶于乙醇，因而用乙醇将DNA 从溶液中沉淀出来。 离心机的使用 平衡 对称放入，盖上盖 设定转速、时间 离心开始 完全停止后开盖 实验步骤 1、取新鲜猪肝4g，用0.14mol/L NaCl — 0.15mol/LEDTA溶液洗去血液，剪碎。加入10ml 0.14mol/L NaCl — 0.15mol/L EDTA溶液，置匀浆器中研磨。（初步破碎细胞）。（已做） 2、取一支5mlEP管，装入糊状物（基本装满），离心5min（10000rpm），弃去上清液 沉淀用0.14mol/l NaCl-0.15mol/l EDTA溶液洗三次。每次加入溶液后用吸管吹打均匀再离心（同上），直到上清液无血细胞。 弃上清液，所得沉淀为DNP（DNA蛋白复合物）粗制品 3、向上述沉淀物加入0.14mol/L NaCl — 0.15mol/L EDTA溶液5ml，分装于2支10mlEP管，然后每管滴加25%SDS溶液0.5mL，边加边振荡。加毕，置60℃水浴20min （不停振荡），直至溶液变得粘稠并略透明，取出冷却至室温。此步骤使核酸与蛋白质分离。 4、每管加入5 mol/l NaCl溶液1mL，蝴蝶形振荡5min。加入约1倍体积的氯仿—异戊醇混合液，蝴蝶形振荡10min，离心10min（4000rpm）。 此步骤后溶液分三个相：上层水相（DNA）；中层变性蛋白质相；下层有机相和残余的RNA。 5、吸出上清液，弃去沉淀。向上清液中缓慢加入1.5—2倍体积的95%乙醇，DNA沉淀析出，［离心（4000rpm）10分钟］ 用玻棒搅出的丝状物则为粗DNA * * *
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