第14章 基因工程与蛋白质工程PPT.ppt

图14-3 放射性探针检测法筛选 DNA重组体 ( 3 ) R 一环检测法RNA 通过取代与它序列一致的DNA 链，同相应的另一条DNA 杂交，被取代的DNA 链与杂交双链RNA 一DNA 可形成一个突环（泡状），称为R 一环。形成R 一环的条件是高浓度（70 % ）的甲酞胺溶液和接近DNA 变性的温度。在这种条件下，将RNA 及DNA 的混合物退火，RNA 便同双链DNA 分子中与它互补的序列退火而形成DNA 一RNA 杂交分子，因为DNA 一RNA 杂交分子比DNA 一DNA 分子更稳定，所以被取代的另一DNA 链就被排斥而呈单链状态。此方法用于筛选重组体时，在有利于形成R 一环的条件下，使待检测的纯化的质粒DNA ，在含有mRNA 的缓冲液中局部变性。如果质粒DNA 存在着与mRNA 探针互补的序列，mRNA 就会取代DNA 中一条链，而与另一链形成双链杂交分子，从而形成R 一环结构。然后在电子显微镜下观察，可直接观察到R 一环。这样便可检出重组体质粒DNA 。 ( 4 )免疫测定法只要一个克隆的目的基因，能够在宿主细胞中表达，合成出外源蛋白质，就可用免疫测定进行检测。免疫测定法分为放射性抗休测定法和免疫沉淀测定法。放射性抗体测定法是将在固体培养基上由菌落所产生的蛋白质，转移到硝酸纤维素膜上，再用相应的带有放射性标记（如125Ⅰ）的抗体进行反应，洗去非特异性吸附的放射性物质后，用放射自显影显示结果。免疫沉淀测定法是用一种特异抗体与外源基因表达产物蛋白质，在固体培养基上发生抗休抗原沉淀反应，根据沉淀物所产生的白色沉淀圈来加以检测。 3 ．表达― 外源DNA 在受体细胞中的转录和翻译 带有目的基因的载体转移到受体细胞成功并筛选出来后，最终目的是要目的基因在受体细胞中得以表达，产生具有功能性的蛋白质或肤。因为基因表达是在一定调节控制下进行的，外源基因在受体细胞中要能表达，必须满足一定的条件。特别是真核基因在细菌中的表达。比如，真核基因表达的启动子能不能被原核细胞RNA 聚合酶识别而进行转录；真核基因转录出的mRNA 是否具有核糖体结合位点，使翻译能顺利进行；翻译产生的蛋白质能否通过细胞膜而排出细胞；外源蛋白是否会被受体细胞中的蛋白酶降解而失活。总之，基因工程要达到最后目的取得功能蛋白，必须依赖于目的基因的有效转录和mRNA 正确的翻译及翻译后加工，如果这些环节中任何一个环节不能正确地进行，均可导致基因上程的失败。 * 基因工程与蛋白质工程 第一节生物工程概述 一、生物工程的概念及研究技术 二、生物工程在现代工业、农业、医学实践中的应用  一、生物工程的概念及研究技术 1 ．基因工程― 在分子水平的遗传操作技术基因工程是生物工程的主体和核心。它是指对不同生物的遗传物质（基因），在体外人工“剪切”、“组合”和“拼接”，使遗传物质重新组合，然后通过载体（微生物质粒、噬菌体、病毒），转人微生物或高等生物细胞内，进行无性繁殖(称为克隆，clone ) ，并使所需要的基因（称为目的基因）在细胞内表达，产生出人类所需要的新产品，或创建新的生物类型。基因工程卞要涉及DNA 的复制、转录和表达，是在分子水平上的一种操作技术，所以它是分子水平的生物工程。转基因动植物就是利用重组DNA 技术，将动物植物或微生物中经过鉴定和分离的特定基因，经过精心设计后转移到动植物体内，实现定向改造而获得新品种或产生新的生物功能。 一、生物工程的概念及研究技术 2 ．细胞工程― 遗传物质在细胞间的转移细胞工程（cell engineering ）是在细胞水平和亚细胞水平的生物工程。包括细胞融合、核移植、细胞大规模培养快速繁殖技术和细胞克隆技术。细胞融合是不同种类的细胞，通过生物学、化学或物理学方法，使其原生质体融合在一起，这可以克服远缘种间的不亲和性，扩大遗传重组范围，筛选杂种后代；细胞大规模培养技术，是以工业生产为目的，不受气候、季节等限制，从大量培养的细胞中获得药物和其他有用物质；组织培养快速繁殖技术，是利用动植物组织和细胞的全能性，进行快速的无性繁殖，在比天然生长发育短得多的时间内得到动植物幼苗或组织，便于工业化生产。此外，还有通过显微或超微技术，将一种细胞的细胞核或某种细胞器转移到另一种不同细胞中的核移植和细胞质移植技术，可以产生具有超级功能的新细胞。 一、生物工程的概念及研究技术 3 ．酶工程― 酶的改造与设计酶工程（enzyme engineering ）包括酶的开发与生产、酶的固定化和酶的分子改造与新酶研制等技术。在工业生产上，就是在一定的生物反应器中，利用酶的催化作用，将相应的原料转化成所需的产品。酶的固定化技术，就是将酶（或细胞）与高分子化合物相结合，成为固相，便于长期反复使用进行连续化生产。这样，既保证了酶的特异催化作用，又