11DNA组技术基本工具.pptVIP

§1－1 DNA重组技术的基本工具 gene engineering 基因拼接的理论基础 DNA是生物的主要遗传物质 DNA的基本组成单位都是四种脱氧核苷酸 双链DNA分子的空间结构都是规则的双螺旋结构 外源基因在受体内表达的理论基础 基因是控制生物性状的独立遗传单位 遗传信息的传递都遵循中心法则阐述的信息流动方向 生物界共用一套遗传密码 基因工程 基因拼接技术、 DNA重组技术 按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出人类所需要的新的生物类型和生物产品。 是在DNA分子水平上进行设计和施工的。 定向地改变生物的遗传性状 DNA重组技术的基本工具 分子手术刀 限制性核酸内切酶（限制酶） 分子缝合针 DNA连接酶 分子运输车 基因进入受体细胞的载体 ⒈分子手术刀——限制性核酸内切酶（限制酶） 限制性核酸内切酶 作用机制: 水解DNA分子的磷酸二酯键 概念:生物体内的一种酶，能将外来的DNA切断，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，可以保护原有的遗传信息。 切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶。 分布：主要存在于微生物（原核生物）中，已从近300种不同微生物中分离出了约4000种限制酶 EcoRⅠ限制酶切割DNA分子示意图 黏性末端 切割DNA分子示意图 平(头)末端 ⒉DNA连接酶——分子缝合针 将2条DNA片段连接成新的DNA分子，恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 ⒉DNA连接酶——分子缝合针 T4DNA连接酶 ⒊基因进入受体细胞的载体----分子运输车 作用 作为运载工具，将目的基因转移到宿主细胞中去； 利用它在宿主细胞内对目的基因进行大量的复制（克隆） 类型 细菌细胞质的质粒 λ 噬菌体的衍生物 动植物病毒 运载体必需满足的条件 能够在宿主细胞中复制并稳定地保存； 有一至多个限制酶切点，而每种酶的切点最好只有一个，以便与目的基因连接； 有一定的标记基因，便于进行筛选 必须是安全的（对受体细胞无害，不选用霍乱弧菌的质粒） 天然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，需人工改造 限制酶切割位点所处的位置必须是在所需的标记基因之外，这样才能保证标记基因的完整性，有利于对目的基因的检测 质粒 裸露的、结构简单、独立于细菌染色体（拟核）外，具有自主复制能力的双链环状DNA分子。 携带外源DNA片段的质粒进入受体细胞后，停留在细胞中进行自我复制，或整合到染色体DNA上，随染色体DNA进行同步复制。 EcoRⅠ限制酶切割DNA分子示意图 EcoRⅠ限制酶切割DNA分子示意图 P7-2 联系你已有的知识，想一想，为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNA？ 提示：迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们各自可以识别和切断DNA上特定的碱基序列。 细菌中限制酶之所以不切断自身DNA，是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，对于外源入侵的DNA可以降解掉。生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵 P7－3 天然的DNA分子可以直接用做基因工程载体吗？为什么？ 不是，作为基因工程使用的载体必需满足以下条件。 载体DNA必需有一个或多个限制酶的切割位点，以便目的基因可以插入到载体上去。这些供目的基因插入的限制酶的切点所处的位置，还必须是在质粒本身需要的基因片段之外，这样才不至于因目的基因的插入而失活。 载体DNA必需具备自我复制的能力，或整合到受体染色体DNA上随染色体DNA的复制而同步复制。 载体DNA必需带有标记基因，以便重组后进行重组子的筛选。 载体DNA必需是安全的，不会对受体细胞有害，或不能进入到除受体细胞外的其他生物细胞中去。 载体DNA分子大小应适合，以便提取和在体外进行操作，太大就不便操作。 实际上自然存在的质粒DNA分子并不完全具备上述条件，都要进行人工改造后才能用于基因工程操作。 P7-4 DNA连接酶有连接单链DNA的本领吗？ 提示：迄今为止，所发现的DNA连接酶都不具有连接单链DNA的能力，至于原因，现在还不清楚，也许将来会发现可以连接单链DNA的酶。 P4－－寻根问底 1.根据你所掌握的知识，你能分析出限制酶存在于原核生物中的作用是什么吗？ 提示：原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限