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Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞 　 Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞 撰写　金伯泉 　　测定细胞免疫功能首先要从人或动物外周血或组织中获取有活性的细胞，如淋巴细胞、巨噬细胞、粒 细胞等。取得有活性的细胞应根据不同目的，采用不同方法，考虑(1)细胞纯度；(2)细胞获得量；(3)细胞 活力；(4)使用方法的简易程度和本室条件等。目前常用Ficoll密度梯度离心法直接分离和纯化外周血单个 核细胞。 　　(一)　原理: 1.2g／ml仍未超出正常生理性渗透压,也不穿过生物膜。红细胞、粒细胞比重大，离心后沉于管底；淋巴细 胞和单核细胞的比重小于或等于分层液比重，离心后漂浮于分层液的液面上，也可有少部分细胞悬浮在分 层液中。吸取分层液液面的细胞，就可从外周血中分离到单个核细胞。 　　(二)　方法: 　　1.　在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。 　　2.　取肝素抗凝静脉血与等量Hanks液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上， 注意保持清楚的界面。水平离心2000rpm×20分钟。 　　3.　离心后管内分为三层，上层为血浆和Hanks液，下层主要为红细胞和粒细胞。中层为淋巴细胞分 离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带(如下图)，单个核细胞包括淋巴细胞 和单核细胞。此外，还含有血小板。 　　4.　用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。置入另一短中管中，加入５倍以上体积的Hanks液或 RPMI1640，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次。 　　5.　末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。取一滴细胞悬液与一滴 0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。 　　单个核细胞浓度(细胞数／1毫升细胞悬液)＝ 　　　　　　　　　4个大方格内细胞总数 　　　　　　　　　──────────　×　10４×2(稀释倍数) 　　　　　　　　　　　　　　4 　　6.　细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。计数200个淋巴细胞。计算出活细胞百分 率。 　　　　　　　　　　　　　活细胞数 　　　　　活细胞百分率＝──────　×100％ 　　　　　　　　　　　　　总细胞数 　　用本法分离PBMC，纯度在90％以上，收获率可达80～90％，活细胞百分率在95％以上。　　 (三)　试剂和材料: 　　比重1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺(商品名为淋巴细胞分离液)。 　　Hanks液(无Ca２＋、Mg２＋) 　　10％小牛血清RPMI1640 　　0.2％台酚兰染色液，用生理盐水或等渗的PBS配制。 　　肝素用Hanks液或生理盐水稀释成500单位／ml，牽9凝人外周血肝素用量约为50单位／1毫升血。 /topic/006/technich/exp6_1.htm (1 of 3)2005-7-31 13:09:41 Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞 　　短中管、毛细滴管、1毫升和10毫升刻度吸管。 　　无菌干燥注射器针头。 　　碘酒，75％酒精，无菌棉球，镊子，橡皮止血带。 　　血球计数板、显微镜、水平式离心机。 　　(四)　注意事项: 　　1.　抽取人外周静脉血时要注意无菌操作。 　　2.　操作全程应尽可能短时间内完成，以免增加死细胞数。 　　3.　用淋巴细胞分离液分离PBMC时，离心机转速的增加和减少要均匀、平稳，使保持清晰的界面。 胺。 　　(五)　附录 　　1.　Hanks液(无Ca２＋、Mg２＋)配制法 　　　　NaCl 8.0克 　　　　KCl 0.4克 　　　　Na２HPO４·12H２O 0.12克 　　　　KH２HPO４　　　　　　 　　0.06克 　　　　葡萄糖　　　　　　　　　　1.0克 　　　　双蒸水　　　　　　　　　 1000毫克 　　　　1％酚红液　　　　　　　　　 2毫克 　　将上列成分混合后溶化，分装于500毫升盐水瓶内，8磅15分钟灭菌，4℃冰箱保存，临用时调PH至7.3 ～7.6。 　　2.　细胞分层液配制法