猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型鉴定与药敏试验.docVIP

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型鉴定与药敏试验 　　摘要：从江苏泰州地区疑似猪传染性胸膜肺炎发病猪采集病料，经细菌分离培养得到了３株分离株ＴＺＡ１、ＴＺＡ２和ＴＺＡ３株。经形态学检查、ＣＡＭＰ试验、生化试验和血清型鉴定，确定ＴＺＡ１株和ＴＺＡ２株为血清１型，ＴＺＡ３株为血清３型。药敏试验显示，３株分离菌株对恩诺沙星、阿齐霉素、头孢唑肟高度敏感。 　　关键词：猪胸膜肺炎放线杆菌；血清型鉴定；药敏试验 　　中图分类号：Ｓ８５８．２８文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）04－0780-03 　　胸膜肺炎放线杆菌（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，ＡＰＰ）是革兰氏阴性、有荚膜的多形球杆菌，有时呈线性，无鞭毛，不运动，不形成芽孢。根据培养时是否需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Ｎｉｃｏｔｉｎａｍｉｄｅ ａｄｅｎｉｎｅ ｄｉｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＮＡＤ，又称Ｖ因子），可将ＡＰＰ分为生物Ⅰ型和生物Ⅱ型，生物Ⅰ型为ＮＡＤ依赖株，包括血清型１～１２ 型和１５ 型，生物Ⅱ型的生长不依赖ＮＡＤ，但需要其他特定嘌呤或嘌呤前产物以辅助生长，含有２个血清型，为血清型１３和１４［１］。猪感染ＡＰＰ后的疾病是猪传染性胸膜肺炎（Ｐｏｒｃｉｎｅ ｃｏｎｔａｇｉｏｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｉａ，ＰＣＰ），急性暴发时有很高的发病率和死亡率。一些病猪康复后常伴有慢性肺炎，导致生长停滞且长期带菌而成为其他猪的传染源，此病给养猪业造成较大的经济损失［２］。本研究从江苏泰州地区部分规模猪场临床表现为胸膜肺炎的病料中进行病原分离和血清型鉴定，并对分离菌株进行药敏试验，以期为泰州地区猪传染性胸膜肺炎的防控、净化提供理论支撑。 　　１材料和方法 　　１．１材料 　　ＰＰＬＯ琼脂和ＮＡＤ购于扬州市广陵区全球通实验用品销售中心；犊牛血清购于杭州四季青生物工程有限公司；常规培养基、生化试剂和药敏纸片（氟苯尼考和强力霉素为自制）购于杭州天和微生物试剂有限公司；ＡＰＰ １、３、５、７、９型阳性血清购于中国农业科学院兰州兽医研究所；金黄色葡萄球菌为本实验室保存；待检病料采集于泰州市规模猪场的疑似猪传染性胸膜肺炎的病猪。 　　１．２试验方法 　　１．２．１细菌的分离培养与形态观察取死亡猪的气管分泌物和肺脏作涂片，革兰氏染色，镜检；同时取病料接种于含２％ ＮＡＤ的ＰＰＬＯ琼脂平板，在５％～１０％ ＣＯ２条件下，３７ ℃培养２４ ｈ。然后挑取可疑菌落涂片，镜检。纯培养后，以４０％甘油生理盐水或２０％脱脂牛奶于－７０ ℃保存备用［３］。 　　１．２．２CＡＭＰ试验用金黄色葡萄球菌在兔血琼脂平板上划一直线，再用分离菌划线与该线垂直但不相接触的２条直线，３７ ℃培养２４～３６ ｈ，观察试验结果。 　　１．２．3生化试验将分离菌株分别接种含有０．０２％ ＮＡＤ的乳糖、葡萄糖、果糖、鼠李糖、阿拉伯糖、甘露醇、山梨醇、靛基质、甲基红、Ｖ－Ｐ试验、硝酸盐、卫星现象和尿素酶等微量生化试管，３７ ℃培养２４～４８ ｈ，观察和记录试验结果。 　　１．２．4药敏试验检测分离菌株对氟苯尼考、强力霉素、复方新诺明、丁胺卡那霉素、恩诺沙星、氨苄西林、头孢唑肟和阿奇霉素８种抗生素的敏感性。将保存好的菌液（浓度稀释到１．５×１０８个／ｍＬ） 均匀涂布在ＰＰＬＯ琼脂上， 然后将药敏纸片贴在平皿上，培养２４ ｈ后观察结果，并按抗菌药物药敏试验判定标准判定分离菌株对不同抗生素的敏感程度［４］。 　　１．２．5菌株血清型鉴定将纯化培养的分离菌株３７ ℃培养２４ ｈ，用生理盐水洗下，制成生理盐水细菌悬液。取１滴ＡＰＰ可疑菌株分别与ＡＰＰ １、３、５、７、９单因子标准阳性血清均匀混合，按照常规方法进行平板凝集试验，观察结果。 　　２结果 　　２．１细菌的形态特征 　　病料涂片以及分离纯化菌革兰氏染色、镜检，都可见有革兰氏阴性、多形态的细菌，多为球杆菌、短杆菌、偶有成丝状的细菌，着色不均。 　　２．２分离菌的培养特性 　　３株分离菌在加入2% ＮＡＤ的ＰＰＬＯ固体培养基上培养２４ ｈ，可见１～２ ｍｍ、露珠状、半透明的菌落。 　　２．３CＡＭＰ试验 　　３株分离菌在靠近金黄色葡萄球菌的地方出现明显的溶血区域，即CＡＭＰ试验阳性。 　　２．4生化试验 　　３株分离菌均呈卫星现象，可水解尿素酶，发酵乳糖、果糖、葡糖糖，不发酵甘露醇、山梨醇、鼠李糖及阿拉伯糖。靛基质、甲基红、Ｖ－Ｐ试验均为阴性。硝酸盐还原试验阳性，生长需要ＮＡＤ。 　　２．5血清型鉴定 　　ＴＺＡ１株、ＴＺＡ２株与ＡＰＰ １型阳性血清发生强烈的凝集发应，鉴定为血清１型；ＴＺＡ３株与ＡＰＰ ３型阳性血清发生强烈的凝集发应，鉴定为血清３型。３株菌株与生理盐水和其他血清型的阳性血清未见凝集现象，结果