酵母基因工程PPT.pptVIP

酵母基因工程;第一节 酵母基因工程的发展现状和发展趋势; 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征; 酵母菌作为表达外源基因受体菌的特征;酵母基因工程的发展现状;2、酵母表达异源蛋白 （1）表达水平 酵母表达系统主要用于表达外源基因，表达水平的高低直接关系到其他应用价值。酵母的高效表达主要从3个方面实现：一是通过开发高效的启动子提高和控制外源基因的转录水平；二是提高表达载体在细胞中的稳定性；三是通过多次同源重组以及rDNA介导的整合两种方式提高表达基因在细胞中的拷贝数。 （2）表达质量 除表达水平外，外源基因表达质量的好坏也直接关系到酵母表达系统的应用价值。 ;酵母基因工程的发展趋势;第二节 酵母表达系统; 酵母菌的转化系统;酵母菌的转化程序;酵母菌的转化程序;酵母菌的转化程序;转化质粒在酵母细胞中的命运;用于转化子筛选的标记基因;用于转化子筛选的标记基因;二 常用酵母表达系统 利用酿酒酵母和巴斯德毕赤酵母现已开发出成熟的表达系统，并在科学研究和基因工程实践中扮演了重要的角色。除此之外，利用乳酸克鲁维酵母，多形汉逊酵母、粟酒裂殖酵母和解脂耶氏酵母也开发了各具特色的表达系统。 ;酿酒酵母表达系统;酵母菌中的野生型质粒; 目前已发展和建立的酿酒酵母表达载体既有整合性载体又有附加体型酵母。 应用于酿酒酵母的附加体型表达载体多为大肠杆菌—酿酒酵母穿梭表达质粒，此载体可在细菌宿主中进行选择和增殖，常使用pUC质粒的复制起点和氨甲苄青霉素抗性选择标记。酵母部分通常包括酵母的2um质粒的复制区，用于酵母转化的选择元件主要是营养缺陷型相关的基因。这类载体能独立于酵母染色体之外复制，常以30或更多拷贝存在，但没有选择压力时不稳定。 这种类型表达载体在细胞中必须有选择压力才能稳定表达，不适于工业化生产，但是对于科学研究中利用酵母重组体系对外源基因进行定向进化时，可简单地通过抽提质粒而获得突变基因。; 另一类载体没有在酵母中复制的质粒复制区，而是利用同源片断将载体整合到染色体上，这类染色体稳定性高???但拷贝数低。于附加型载体一样，该类载体也有用于酵母转化的选择元件和原核生物部分的复制起始序列以及某种抗生素抗性基因。 在表达时，外援基因与来自酿酒酵母的高效表达基因启动融合，这些启动子既有组成型表达，也有诱导型表达。;目前通过两种方式提高拷贝数： （1）用酵母转座子以产生多个插入拷贝； （2）通过rDNA介导的重组插入到核糖体DNA簇中，在宿主的染色体上以约150个串联重复序列存在。 酿酒酵母表达系统也有其不足之处，主要是：（1）较难进行高密度发酵，因为其发酵时会产生乙醇，乙醇的积累会影响酵母本身的生长；（2）蛋白质的分泌能力较差。;二 常用酵母的表达系统;2 巴斯德毕赤酵母表达系统 巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌，能在低廉的甲醇培养基中生长，甲醇可高效诱导甲醇代谢途径中各酶编码基因的表达，因此生长迅速、乙醇氧化酶基因AOX1所属强启动子、表达的可诱导性是巴斯德毕赤酵母表达系统的三大优势。 由于巴斯德毕赤酵母没有合适的自主复制型载体，所以外源基因的表达序列一般整合入受体的染色体DNA上。在此情况下，外源基因的高效表达在很大程度上取决于整合拷贝数的多寡。目前已有20余种具有经济价值的重组蛋白在巴斯德毕赤酵母系统中获得成功表达。 ;甲醇酵母表达系统具有以下优点: （1）启动子强并受甲醇严格诱导，因此可用于调控外源蛋白的表达。 （2）作为真核表达系统，能对重组蛋白进行翻译后必要的剪接、折叠和修饰，糖基化也更接近高等真核生物甚至人类。 （3）甲醇酵母在转化、基因转换、基因替换、基因敲除等基因操作技术上与酿酒酵母相似，简单易行，但是外源蛋白的表达量却比酿酒酵母增加了10—100倍。 （4）重组菌的遗传性质稳定，表达量和分泌效率高，适于大规模发酵。 （5）能在无机盐培养中迅速生长，易进行工业化生产，高密度培养干细胞量可达100g/L以上。 ;在巴斯德毕赤酵母中有2个基因（AOX1 AOX2）编码QOX，约占全部可溶性蛋白质的30%以上，基因严格的受甲醇的诱导和调控。 甲醇酵母表达系统的缺点： 1分子生物学的研究基础差，要对其进行遗传改造困难较大 2不是一种食品微生物，发酵时又要添加甲醇，所以，要用它来生产药品或食品还没有被广泛接受。 3发酵虽然能达到很高的密度，但是发酵周期一般较长。;(1)载体的发展 由于巴斯德毕赤酵母没有稳定的附加体质粒，所以一般用整合型质粒作为外源基因的表达载体。整合为点一般位于组氨醇脱氢酶编码基因HIS4区或 AOX