白介素-1对培养人表皮黑素细胞增殖及黑素合成影响研究.docVIP

白介素-1对培养人表皮黑素细胞增殖及黑素合成影响研究 　　[摘要]目的： 建立正常人表皮黑素细胞体外培养体系, 观察不同浓度的白介素-1α，白介素-1β对体外培养正常人黑素细胞的细胞增殖及黑素合成的影响。方法：采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法测定白介素-1α及白介素-1β对黑素细胞增值的影响，NaOH裂解法测定黑素生成量，流式细胞仪检测黑素细胞的凋亡率。结果：白介素-1α及白介素-1β对黑素细胞活力有抑制作用,能使细胞增殖能力降低,黑素合成减少，增加黑素细胞的凋亡率。结论：白介素-1α及白介素-1β对体外培养的黑素细胞增殖及黑素生成都有抑制作用, 这为临床应用白介素-1α及白介素-1β治疗色素性疾病提供了实验依据。 　　[关键词]白介素-1α；白介素-1β；黑素细胞 　　[中图分类号]R758 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2012）06-0952-04 　　黑素的合成是个极其复杂的过程,在体内受金属离子、细胞因子、激素等各种因素的调节。多种细胞因子对于黑素细胞的数量、形态、酪氨酸酶活性、细胞间粘附分子-1等均有不同程度的影响[1]。IL-1是一个多功能的促炎症细胞因子家族,几乎所有有核细胞均能产生IL-1。为了研究白介素-1（Interleutin-1, IL-1）对人表皮黑素细胞增殖及黑素合成的影响，为临床应用IL-1治疗色素性疾病提供实验依据，笔者建立了正常人表皮黑素细胞体外培养体系，采用不同浓度的白介素-1α及白介素-1β作用于体外培养的黑素细胞, 观察了IL-1α及IL-1β对表皮黑素细胞增殖及黑素合成的调节作用, 现将结果报道如下。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料及仪器：MCDB-153培养基，牛胰岛素，人转铁蛋白，L-Dopa, IL-1α，IL-1β，DMSO，MTT 均购自美国Sigma公司。重组人表皮生长因子( rhEGF)购于美国Peprotech公司。牛垂体提取物(BPE)购于美国Invitrogen公司。10%新生小牛血清购自Hyclone公司。EDTA-Na2购自美国Gibco公司。氢化可的松0.5μg/ml，青霉素100IU/ml，链霉素100IU/ml，胰蛋白酶，苔盼兰均系国产。培养瓶、96孔板和6孔板均购于美国Corning公司；显微镜：观察细胞用的是OLYMPUS CK2型号；细胞计数用的是OLYMPUS CKX41型号， 照相用的OLYMPUS CH2型号；酶联免疫检测仪；流式细胞仪。标本经患者知情同意后取自18～35岁行包皮环切术的正常人包皮。 　　1.2 方法 　　1.2.1 正常人黑素细胞的培养[2-3]：将上述包皮标本消毒、修剪,用含0.2g/L EDTA-Na2的0.25%胰蛋白酶消化和离心后,将获得的MC 进行培养。在倒置显微镜下观察, 细胞呈明显的两极或多极树突形态。 　　1.2.2 黑素细胞鉴定[4-5] 　　1.2.2.1 L-Dopa染色：将传代纯化后的黑素细胞，经含0.2 g/L EDTA- Na2的0.25%胰蛋白酶消化后接种于已预先放置盖玻片的 6 孔板内，待细胞贴壁并稳定生长后弃去培养液，并用预热的PBS液洗涤数次。用2.5g/L戊二醛固定后，加入用黑素细胞培养液配制的1g/L L-Dopa，37℃ 孵育4h，其间换液1次，风干后甘油封片，照相。 　　1.2.2.2 Fontana银染：在0.15%硝酸银溶液中加入适量氨水配制成氨银液，将传代纯化的黑素细胞用戊二醛固定后加入氨银液，避光浸染约30min，PBS液漂洗3次后置倒置显微镜下观察，照相。 　　1.2.2.3 S-100 蛋白免疫组化染色：将传代纯化后的黑素细胞，经消化后接种于已预先放置盖玻片的 6 孔培养板内，待细胞贴壁后去掉培养液。用2.5g/L 戊二醛固定后，PBS液洗涤数次，加入3%的H2O2，室温30min，以去除内源性过氧化物酶；再次用PBS液洗涤数次，滴加1：20稀释的羊血清，室温下处理15min；加入1:200兔抗 S-100蛋白的多克隆抗体，4℃ 过夜；洗涤后加入生物素标记的羊抗兔抗体，37℃、湿盒孵育1h，再次洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，37℃、湿盒孵育1h。洗涤后DAB染色，蒸馏水适时终止，苏木素复染后用加拿大胶封片，照相。 　　1.2.3 黑素细胞增殖的测定：采用四甲基偶氮唑蓝比色法（MTT法）。 倒置显微镜下观察，细胞培养至80%汇合时，弃培养液上清，加入含0.2 g/L EDTA- Na2的0.25%胰蛋白酶共1～1.5ml，在75cm2的细胞培养瓶内37℃孵育3～5 min，镜下观察约80%脱落，加入5ml左右的含有10%新生小牛血清的MDCB-153培养基终止消化，转移细胞悬液到15ml离心管，1 500rpm离心3min，弃去上清