钩藤抑制基质金属蛋白酶活性及治疗脑血管疾病机理实验研究.docVIP

钩藤抑制基质金属蛋白酶活性及治疗脑血管疾病机理实验研究 　　【摘要】　目的　本文旨在研究钩藤是否具有抑制基质金属蛋白酶（MMPs）活性的作用，从而为从分子水平上研究钩藤治疗脑血管疾病的机理奠定基础。方法　根据抑制MMPs活性后底物降解速率降低的原理，通过检测底物降解速率，测定中药钩藤提取物对MMPs的抑制作用。结果　钩藤具有抑制MMP-16活性的作用，其抑制活性IC50=52μg/ml。结论　钩藤具有抑制基质金属蛋白酶活性的作用，其治疗脑血管疾病的机制可能因为其具有抑制脑血管中的基质金属蛋白酶活性有关。 　　【关键词】　钩藤；基质金属蛋白酶；脑血管疾病 　　doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2013.01.023　文章编号：1004-7484（2013）-01-0023-02 　　脑血管疾病主要包括高血压、脑缺血、脑出血、脑血栓［1］，这一系列疾病致残率及致死率及高，严重危害人民的健康并增加了社会医疗的负担。对于脑血管疾病的进一步诊治，已经成为目前关注的热点问题。国外文献发现，大部分脑血管疾病发病与基质金属蛋白酶的变化有关［2］，基于此，MMPs已成为治疗及预防脑血管疾病的一个新靶点。目前应用于临床脑血管类疾病治疗的药物多为中药制剂，钩藤作为中药防治脑血管疾病的常规药物，其用药历史悠久，费用较低，且已知副作用较少因而被广泛应用于临床中［3］。本实验对钩藤体外抑制基质金属蛋白酶活性进行研究如下。 　　1　实验仪器与实验材料 　　1.1　实验材料　钩藤（内蒙古民族大学附属医院中药房提供的道地药材），缓冲溶液应用自治（50mM　HEPES，10mM　CaCl2，0.2M　NaCl，0.05%　Brij-3520μM　ZnSO4），荧光底物DQ-gelatin（Sigma公司、美国）。 　　1.2　实验仪器　Bio-Tek　ELx-808荧光酶标仪（宝特），DNP-9272-1　电热恒温培养箱（常州恒德仪器制造股份公司）。 　　2　原理与方法 　　2.1　实验原理　本实验采用可激发荧光的底物为底物，基质金属蛋白酶降解荧光底物后发荧光，通过荧光酶标仪检测荧光的变化强度并记录数值。如果在反应体系中加入药物的提纯物质，药物提纯产物中的抑制成分与基质金属蛋白酶结合，从而影响荧光底物的反应，使其荧光强度发生变化。 　　2.2　??验方法 　　2.2.1　提取物的制备　将钩藤3g放入水中（100摄氏度）持续时间3小时，滤纸三重滤过得沉淀物，应用冻干机处理后，得到钩藤水提取物。配制的药物起始浓度为1g/l每升增加浓度1g，最高浓度为6g/l的水提取物溶液。 　　2.2.2　抑制活性的测定　将6种浓度的钩藤水提取物分别取1μl与一定量的基质金属蛋白酶-16加入96孔酶标板中，然后加入缓冲溶液，使其最终体积为50μl，放入37℃培养箱中孵育30分钟，然后加入含有0.2μg荧光底物缓冲溶液50μl，最终反应体系为100μl，钩藤水提取物最终浓度分别为10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml和60μg/ml，立即用Bio-Tek　ELx-808荧光酶标仪进行计算，发射波长为520nM，激发波长为460nM。实验时间为500秒。仪器计算的荧光强度就等同于酶降解底物活力的强弱。 　　2.2.3　抑制活性计算　用Vo代表没有加入抑制剂组的荧光强度变化，Vi代表加入抑制剂组的荧光强度变化，钩藤的抑制百分数用下边的公式表示：1—Vi/Vo=抑制百分数（%），当抑制百分数为50%时，则为钩藤抑制基质金属蛋白酶活性的IC50。 　　3　结果 　　具体结果如下，图中“Mean　V”表示随时间变化的荧光强度的变化速率，可以作为相对的底物降解速率，根据实验方法中所给出的公式，能够计算出不同浓度的钩藤提取物对基质金属蛋白—16的抑制百分数。通过以上数据，我们能够推测基质金属蛋白酶—16的活性抑制50%时所需要的钩藤的量，如图8，IC50=52μg/ml。 　　3　讨论 　　钩藤始载于《名医别录》，原名钓藤。甘苦；微寒，归肝、心包经，具有清热平肝；熄风止痉的作用［4］，被历代医家成为因其疗效确切，副作用较少，长期以来一直被应用于脑血管疾病的治疗之中。 　　基质金属蛋白酶是一类自然进化中高度保守的酶。基质金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）通过自身的表达调控基质金属蛋白酶的含量。当机体出现神经系统疾患时，基质金属蛋白酶受到疾病影响后其表达水平向上调节，使基质金属蛋白酶抑制剂与基质金属蛋白酶之间的平衡失控，因为这种基质金属蛋白酶含量的升高，细胞外基质成分被过多降解，从而为许多疾病如脑血栓、脑出血、高血压等疾病［5］的发生创造条件，Galis等人的研究表明基质金属蛋白酶是造成斑块不稳