3PCR方法PPT.ppt

融合PCR 原理： 通过在引物的5’端添加一段帽子序列，这段帽子序列与靶1序列同源；而引物的3’序列与靶2序列互补。 在第一个PCR反应中，以靶2序列为模板，使靶2序列得到扩增，扩增产物的3’端均携带与靶1序列互补的序列。 以这样的扩增产物为引物，在第二个PCR反应中，以靶1序列为模板，使靶1序列得到扩增。 这样得到的产物既含有靶1序列，又含有靶2序列，成为一段长片段的融合序列。 3个独立的PCR反应 获得一个标签序列，采用引物tag-F和tag-R. 获得目的基因起始密码子ATG的上游序列，约500bp，采用引物为up-F和up-R，其中up-R含有24bp的序列与标签序列的5’互补。 获得目的基因起始ATG及其下游序列，约500bp，采用引物为do-F和do-R,其中do-F含24bp序列与标签序列的3’互补。 标签序列 tag-F tag-R 上游序列 目的基因 ATG up-F up-R 上游序列 目的基因 ATG do-F do-R 标签序列 上游序列 目的基因 ATG 标签序列 目的基因 上游序列 标准PCR 标准PCR 标准PCR 融合PCR 降落PCR 指每一个（或n个）循环降低1℃（或n℃）退火温度（touchdown）,然后以此退火温度进行10个左右的循环。 正确与非正确退火温度之间的1℃差异将造成PCR产物量的4倍差异，相差5 ℃，就会产生45（1024）倍的优势。 设计： 退火温度起始在高于计算的Tm值的15 ℃左右，退火温度以每次1－2 ℃逐渐降低，直到Tm值以下5 ℃，当达到特异的引物和模板结合的Tm值时，扩增开始。 当退火温度降到非特异扩增发生水平时，特异产物会有一个几何级数的起始优势，特异产物会竞争胜出非特异产物，特异产物优先扩增，产生单一的占主导地位的扩增产物。 外显子捕获PCR 转录前体mRNA 成熟mRNA 剪切位点的一致性：GT/AG规则 设计一个带有一套完整的剪切位点的外显子和内含子序列（剪接盒载体），将外源DNA插入载体的克隆位点（位于内含子中），构建重组载体，转染真核细胞，外源片段带有剪接供体和受体位点，剪切可进行。 利用载体本身启动子，在真核细胞中转录形成mRNA，载体上已知序列为引物，逆转录PCR，形成cDNA(捕获的外显子)。 剪切 流程： 制备载体 基因组片段克隆至载体 转化E.coli 提取重组质粒并转染至cos-7细胞中 提取RNA 合成cDNA 一级PCR 二级PCR 克隆PCR产物 鉴定 载体设计要素： 外显子 内含子（克隆位点） 外显子 功能强大的真核基因启动子 原核生物复制子及生化选择标记；真核生物的复制子、启动子、加尾信号。 分子标记在家畜育种中的应用 近10年来，分子遗传学和分子生物学有了突飞猛进的发展，主要表现在： 大量DNA水平上的分子遗传标记及其检测技术； DNA序列测定技术； 转基因技术； 核移植（体细胞克隆）技术； 这种发展正在或将要对家畜育种产生巨大的影响，尤其是大量的分子标记，为我们动物的基因组提供了非常好的信息，这些信息可用于： QTL的检测； 标记辅助选择； 标记辅助基因导入； 标记辅助杂种优势利用； 标记资源保存； 研究品种起源与发展； 亲子鉴定；等等。 研究最多 遗传标记是指那些可准确鉴别的能反映个体特异性的遗传特征，是一类与目标基因紧密连锁，易于从表现型上直观鉴别的等位基因。通过对标记性状的直接选择，从而实现对目标基因的间接地选择。 理想的标记应具备： ☆高多态性，多态是指标记在群体中有多种基因型 ，多态程度高，个体之间在标记上就能表现出差异，所提供的信息也就越多； ☆数量多，而且均匀地覆盖整个基因组； ☆对它的测定不受年龄、性别、环境等因素的限制； ☆共显性，能够准确判别所有可能的基因型。 传统的标记有： 1、形态学标记：主要指一些具有鲜明外部特征的质量性状，并可以通过表型来推断其基因型，如毛色、有无犄角等； 2、细胞学标记：是指染色体形态、数目和结构的变异，用具有异常染色体的个体与具有正常染色体的个体杂交或用染色体替换等手段，可对一些基因进行定位； 3、生化标记：是在血液或乳中的蛋白质（包括酶）的多态性，这些多态性可通过免疫反应或电泳技术反映出来，并由此判定其基因型，如血型抗原、血液蛋白、乳蛋白、同工酶等。 传统标记的主要缺陷：多态性和数量有限。 分子标记 （molecular marker） Botstein 限制性片段长度的多型性 RFLP (Rest