基因工程第二章3.pptxVIP

第一节 限制性内切酶 基因的重组与分离，涉及到一系列相互关连的酶催化反应,特别是核酸内切限制酶(restrictionendonucleases)和DNA连接酶(1igase)的发现与应用，才真正使DNA分子的体外切割与连接成为可能。 (限制)10- 4E.coli K1λ(B)修饰1E.coli B(限制)10- 4λ(K)修饰一、寄主限制与修饰体系（R/M体系）20世纪60年 W.Arber、H.Smith 和D.Nathans 等首先发现,为此获得了1978年诺贝尔生物医学奖R/M定义：R/M中的限制作用（restriction)是指一定类型的细菌可以通过限制酶的作用，破坏入侵的噬菌体DNA（外源DNA）导致噬菌体寄主幅度受到限制的现象R/M中的修饰作用(modification)是指寄主本身的DNA由于合成后通过甲基化作用得以甲基化，使DNA获得修饰，从而避免遭自身限制酶的破坏 限制与修饰与三个连锁基因有关 hsd R编码限制性核酸内切酶 hsd M编码产物是DNA甲基化酶 hsd S表达产物的功能则是协助上述两种酶识别特殊的作用位点。寄主的限制与修饰有两个方面的作用 1、保护自身的DNA不受限制，2、破坏外源DNA使之迅速降解。 细菌正是利用限制与修饰系统来区分自身 DNA 与外源 DNA 的。EcoRⅠ切割位点二、限制性内切酶(RE)限制性内切酶是一类能够识别双链DNA分子中的某种核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。 分类 Ⅰ Ⅱ Ⅲ酶分子的结构与功能三亚基多功能酶单一功能酶二亚基双功能酶限制与修饰的新闻系酶蛋白同时具有甲基化作用酶蛋白不具有甲基化作用酶蛋白同时具有甲基化作用限制与修饰的辅助因子ATP Mg2+SAM(S-腺苷蛋氨酸） Mg2+ATP Mg2+SAM(S-腺苷蛋氨酸）识别序列特异性，非对称序列特异性，旋转对称序列特异性，非对称序列切割位点特异性位点5’端至少1000bp在识别序列内部或附近距特异性位点3’端24-26bp处切割方式随机切割特异切割特异切割1、 Ⅱ类RE（1）.命名 主要内容是: ①基本名称 有机体属名的第一个字母 ( 大写 ) 和种名的前两个字母 ( 小写 ), 组成酶的②菌株 第一个字母加在基本名称之后 ; 大写字母表示酶的编码基因为染色体外遗传成分。③发现次序 罗马数字表示④系统名称RE为R, 甲基化酶为 M ,通常省略例如 R-HindIII表示限制性核酸内切酶 , 相应的甲基化酶用 M- HindIII 表示。 但在实际应用中 , 尤其是在上下文已交代得很清楚时 , 限制性内切酶的系统名称 R 常被省略。HindIIIH = genus Haemophilus in = species influenzae d = strain Rd III = third endonuclease isolated2.识别序列A 一般识别序列为4-8bp，大部分为双重旋转对称的回纹结构，即一条5’- 3’与另一条为3’- 5’的碱基相同 B 在某些5或6bp的识别序列中，存在内部简并或外部简并。 EcoR Ⅱ 可切割CAGG CCGG内部简并 CTGG XhoⅡ 可切割R GATCY外部简并 Y ： T或 C R ：A或G简并不影响内切酶和甲基化酶的活性，增加了目标序列的频率C 同裂酶isoschizomers)指来自不同有机体，识别切割相同序列的一组酶 切割位置相同Hind III和 Hsa I 均 A AGCTT 切割位置不同Xma I C CCGGG Sma I CCC GGG甲基化影响同裂酶是否切割 Msp I Hpa Ⅱ 为同裂酶 当识别序列CC＊GG的第二个C甲基化后 Hpa Ⅱ就不能切割了 D 同尾酶同尾酶（isocaudamer）来源各异，识别的靶子序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端。BamHⅠ G↓ GATC,BclⅠ T ↓ GATC，BglⅡ A↓GATC,Sau3AⅠ↓ GATCXhoⅡ R↓ GATC就是一组同尾酶 由同尾酶所产生的DNA片段可通过粘性末端之间的互补作用而连接。在基因克隆中很有用。3. Ⅱ类限制性内切酶的切割方式及意义（1）三种切割方式 A 从识别序列中间切开产生平末端（blunt end) B 从5’-3’链上对称轴左方切开和3’-5’链上对称轴右 方切开形成具有凸出的5’磷酸基团的粘性末端 C 从5’-3’链上对称轴右方切开和3’-5’链上对称轴 左方切开形成具有凸出的3’羟基基