第6章色谱分析法 体内药物分析课件,药物分析究生复试用.重点已标红.pptVIP

内容 TLC GC HPLC 第一节 薄层色谱法 定性 常作为监测手段 定量 薄层扫描 制备薄层色谱制备代谢产物 常用 三、定量分析方法 系统适用性试验 理论板数，分离度，重复性，拖尾因子 内标法 外标法 (五)手性药物的高效液相色谱法 1.概述 对映异构体：空间结构不能重叠，互为镜像关系的立体异构体。相应的药物称为手性药物。 为什么必须对手性药物进行研究： （1）实际上是不同的化合物，它们与体内的大分子的不同立体结构结合，可产生不同的吸收、分布、代谢和排泄过程，从而导致药物动力学参数的变化。 （2）可能具有不同的药理和毒理作用，甚至产生药效拮抗，也可能其中一个对映体导致药物的不良反应。例：沙利度胺。 RP－HPLC（体内药分中应用广泛） 最常用的固定相：十八烷基硅烷键合相（ODS或C18） 最常用的流动相组成： 甲醇－水 、乙腈－水。四氢呋喃、有机酸、缓冲盐。 优点： 1.可将含水体液样品直接进样或只经简单去蛋白处理后进样，简化操作。尤其适用于测定含有极性药物或代谢物的体液样品。 2.体液中内源性杂质多数为极性大的化合物，往往先于药物流出色谱柱，色谱图上这些杂质峰出峰较早，减少了对药物峰的干扰，且有利于及时再进样。 制备高效液相色谱法 用高效液相色谱法分离制备、纯化样品组分的方法。 制备型色谱柱：实验室 内径20－40mm，长10－30cm 1、分离条件的选择： 固定相：与分析型色谱柱相同，但粒径较大。 流动相：等度洗脱，溶剂纯度高，易挥发。 流速：与分析柱比，流速大，目的是为了与分析 柱维持相同的保留时间 一般原则：流量之比是柱内径之比的平方。 2、上样量的影响 质量超载：脱尾，保留时间 缩短。 体积超载：平头峰，半峰宽 等于柱头样品宽度。 质量体积都超载：平头、脱尾 样品溶液不能过浓，否则出现局部超载；溶剂强度不能超过流动相强度，否则破坏色谱柱内平衡。 3、检测器的选择 非破坏性、线性响应范围宽、灵敏度要求不高。 4、分离样品组分收集 馏分收集器：自动、手动。与检测器的连接管路不 能太长。 与相邻色谱峰重叠部分可进行再循环 （四）直接进样分析法 测定生物样本时一般通过预处理，从而达到分离纯化，浓集，易于测定等目的。 随着反相高效液相色谱的广泛应用以及近年来固相萃取技术和柱切换技术的发展，直接进样分析在体内药物分析中的应用日益增加。 （一）直接进样与沉淀蛋白进样 直接进样：用 于反相HPLC，样品浓度足够大，达到检测灵敏度；且含蛋白质量极微，不会污染堵塞色谱柱。如：尿液。 简单除蛋白后进样：血清、血浆。 蛋白沉淀剂：甲醇、乙腈、三氯醋酸等。 缺点：使样品稀释，适用于浓度大的生物样品。 适用于：药物或代谢物极性很大，难于用有机溶 剂提取时。 （二）柱切换技术 柱切换技术是指用阀来改变流动相走向及流动相系统，使洗脱液在特定的时间内从预处理柱切换到分析柱上的一种技术。 1、柱切换高效液相色谱法在体内药物分析中的应用 （1）样品沉淀蛋白后进样 样品中加入蛋白沉淀剂（甲醇、乙腈、三氯醋酸）去蛋白后，将上清液大容量进入预处理柱（短、粒径小5－10μm），组分保留在预处理柱上，杂质被冲掉，从而起到净化浓缩的作用。 注意：预处理流动相应选择水或适当浓度有机溶剂的水溶液，以便使被测组分被保留。且沉淀蛋白后的上清液需加入适当体积的水稀释，以降低有机溶剂的浓度，防止被测组分在净化过程中从预处理柱上被洗脱。 （2）体液直接进样（在线去蛋白） 在以水为主的预处理流动相的引导下，可将大体积的体液样品直接进入预处理柱（短、粒径大25－40μm），在水冲洗下除去蛋白质和一些极性内源性杂质，被测组分则保留在预处理柱上，得到净化和浓缩；然后切换，以分析流动相将被测组分从预处理柱冲至分析柱，进行再分离测定。 （3）全血或组织匀浆直接进样 关键是预处理柱必须使用粗粒径的固相填料（50－90μm）和较大孔径的柱滤板，以便使血细胞易于通过预处理柱。 （4）其他 在线透析、在线衍生化等 2、柱切换HPLC的主要优点 （1）使液－固提取技术与HPLC分析技术结合，具有样品制备和样品测定双重功能。 （2）样品前处理简单且自动化 （3）被测样品组分富集提高了检测灵敏度 （4）精密度高 * * 第六章 色谱分析法 第二节 气相色谱法 优点：具有分离和分析