打破DNA的物种界限——基因工程PPT.ppt

～ 17 ～ 打破DNA的物种界限——基因工程;基因重组（genetic recombination） 指一段DNA在细胞内或细胞间，甚至在不同个体或物种之间进行交换，并能在新的位置上复制或转录，乃至翻译。 ;17.1 基因的天然重组;17.1.1 接合作用(conjugation) ;目录;17.1.2 转化作用（transformation）;　;17.1.3 转导作用;普遍性转导;（1）;（1）;17.1.4 位点特异重组;例1：λ噬菌体DNA的整合;例2：沙门氏菌H片段的倒位重组 ;例3：免疫球蛋白基因的VDJ重排;17.1.5 转座重组;目录;插入序列(insertion sequences, IS)组成 二个分离的反向重复(inverted repeats, IR)序列 特有的正向重复序列 一个转座酶（transposase)编码基因 ;A. 插入序列 B. 转座子;转座的形式： 保守性转座(conservative transposition) 复制性转座(duplicative transposition);17.1.6 同源重组;同源重组的Holliday模型;目录;片段重组体： 切开的链与原来断裂的是同一???链，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA。 拼接重组体：切开的链并非原来断裂的链，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA。 ;同源重组的生物学意义; 基因敲除（gene knockout）：利用同源重组原理，有目的地去除（敲除）实验动物体内某特定基因的技术，以用于观察目的基因的功能;;17.2 基因的人工重组;基本过程：在体外将目的DNA片段与能自主复制的载体连接，形成重组DNA分子，进而在受体细胞中复制、扩增，从而获得单一DNA分子的大量拷贝。 克隆目的基因后，针对该基因进行特定蛋白质或多肽制备以及定向改造基因结构所用的方法及相关的工作统称为基因工程（genetic engineering）。; 基因工程：重组DNA技术的产业化设计与应用;（1）基因工程技术诞生的理论基础（1865-1970’s） 1865年：Mendel的豌豆杂交试验 1944年：Avery的肺炎球菌转化实验 20世纪50年代：Watson和Crick发现了DNA分子的双螺旋结构；Meselson和Stahl证实了DNA的半保留复制 20世纪60年代：Crick提出了“中心法则” ；BrennerCrick提出3联密码子学说；Nirenberg，MattaeiKhorana破译了遗传密码 ;（2）基因工程的诞生（1972—1976年） 20世纪70年代初，人们发现了限制性核酸内切酶、DNA连接酶和可作为基因工程载体的细菌质粒，使基因工程从理论走向实践。 1972年：Berg 用EcoRⅠ分别酶切猿猴病毒SV40 DNA和λ噬菌体DNA并用连接酶将之连接起来, 第一个重组DNA分子诞生。 1973年：Cohen将酶切的DNA分子与质粒连接，并将其转化入E.coli。 至1976年：相关科学家完成了DNA重组相关的载体与受体细胞的安全性改造。;（3）基因工程技术的成熟（1977-1980’s) 1977年，Itakura等人首次在大肠杆菌中表达了人的生长抑素基因；Ullrich等人克隆并表达了人的胰岛素基因。 1978年，美国Genetech公司开发出重组大肠杆菌合成人胰岛素的生产工艺，揭开了基因工程产业化的序幕。 ;（4）基因工程技术的腾飞（1980’s-至今) 1982年：转基因小鼠 1983年：转基因植物技术的建立 1990年：基因治疗技术用于临床 1991年：人类基因组计划正式启动 1996年：体细胞隆羊Dolly诞生 ;;17.2.2 基因工程技术中常用的工具酶;基因工程技术中常用的工具酶;GGATCC CCTAGG;限制性内切酶的发现;限制/修饰系统（restriction/modification system) 细菌的免疫体系，辨认自己的DNA和外来的DNA，并使后者降解掉。;ch3;（1）分类：分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类 Ⅰ型：属于复合功能酶，兼有修饰和切割DNA两种特性，需要Mg2+、ATPs-腺苷酰甲硫氨酸作为催化的辅因子，在DNA降解时伴随有ATP的水解。即它具有核酸内切酶、甲基化酶、ATP酶和DNA解旋酶四种活性。若识别位点上两条DNA链均未甲基化，则行使内切酶功能，并在切割DNA同时或以后转变为ATP酶；若位点上只有1条链被甲基化则发挥修饰功能，使另一条链也甲基化；若位点上两条链均甲基化就与位点解离。其显著特点是识别位点和切割部位不一致，无固定切割位点，一般在识别位点以外的