树突状细胞的分离纯化PPT.ppt

树突状细胞 树突状细胞(dendritic cell , DC)是Steinman在 1973 年首先发现 ,是目前所知的功能最强的抗原提呈细胞（APC）。它的表面表达丰富的与抗原呈递有关的MHCⅠ 类和 Ⅱ 类分子以及多种共刺激分子 ,可能高效地摄取、加工处理和呈递抗原。 成熟DC能有效激活初始型T细胞，DC处于启动、调控、并维持免疫应答的中心环节。 Steinman Steinman因他在“树突状细胞及其在适应性免疫系统方面作用的发现”取得成就，获得2011年诺贝尔生理学或医学奖的1/2. 拉尔夫·斯坦曼于麦吉尔大学学习生物学和化学获得学士学位后，曾就读于美国哈佛大学医学院，并于1968年获得医学博士学位。1970年起就职于洛克菲勒大学，他在1973年提出了树突状细胞的概念，其时他在赞威尔·A·科恩的实验室做博士后。1988年起任该大学免疫学教授，同时担任其免疫学和免疫疾病中心主任 。 虽然专家并不同意斯坦曼依靠自己的治疗方案把寿命延长了4.5年这种说法，但斯坦曼实验室的同事这样相信（好同事呀……）。斯坦曼得的是胰腺癌，一般说来，只有不到5%的人能够多活1年。 DC的来源和分布 DC分布全身各组织脏器（除脑组织外）。langgerhans cells（LC） ，分布于表皮、胃肠道上皮interstitial DC，分布于心、肝、肺、肾等脏器follicular dendritic DC（FDC），分布于淋巴结滤泡区interdigitating cell（IDC ），胸腺依赖区和胸腺髓质 DC的应用 通过不同形式的肿瘤抗原致敏的DC体内注射后 可诱导出特异性抗肿瘤免疫应答 ,但肿瘤患者DC功能均存在一定缺陷 ,应用肿瘤的各种抗原 ,诸如肿瘤特异性抗原、肿瘤相关抗原及完全性细胞抗原 ,以各种手段修饰DC制成疫苗 ,以此免疫荷瘤宿主 ,可产生抗肿瘤免疫。 DC分离纯化方法 物理法：1.根据细胞的黏附性进行分离 2.根据胞的大小比重进行分离 免疫法：淘汰法、流式细胞术法、磁性细胞分离术 免疫磁珠技术原理 免疫磁珠法分离细胞是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。 免疫磁珠法分为阳性分离法和阴性分离法：    阳性分离法－磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞    阴性分离法－磁珠结合不需要的细胞，游离于磁场的细胞为所需细胞 免疫磁珠的分离原理 人外周血树突细胞分离纯化 T细胞 NK细胞 单核细胞的去除 CD4+ 血液树突状细胞的直接 、阳性选择 T细胞 NK细胞 单核细胞的去除 1.取新鲜的人抗凝外周血 , 用密度梯度离心法从中分离获得单个核细胞 2.加入阻断剂及连有半抗原的抗体 3.离心 4.加MACS磁珠标记的抗半抗原抗体 5.细胞分离柱冲洗 CD4+ 血液树突状细胞的直接 、阳性选择 1.将富含树突状细胞的悬液离心 2.加磁珠标记的CD4单克隆抗体 3.离心 4.分离柱冲洗 冲出即为CD4标记的树突状细胞 用FITC 标记HLA-DR, 与表达HLA-DR 细胞结合,通过与对照组相比去除假阳性率 M1, M2为所测样本阳性细胞百分比。在 PBMC 中HLA-DR+细胞占13%左右( 图1) ,而在纯化的CD4+DC细胞中HLA-DR 的表达率达到80%以上(图1) 。 Discussion 斯坦曼获得诺贝尔医学奖说明了现在科学界对通过免疫治疗各种疾病是十分有信心的。 免疫磁珠方法选择性很强，但选择性强的话干扰就变大了，我们可以在这一方面入手。 References 唐岩，唐军民，李银生，伊焕发，戴燕。免疫磁珠技术在分离人外周血树突状细胞中的应用。解剖学通报，2003 陈向荣，石汉平。树突状细胞的分离纯化与鉴定。上海免疫学杂志，2001 伊焕发，唐 岩，甄昱，唐军民，孙红亚。人外周血 CD4+树突状细胞的纯化及鉴定。解剖科学进展，2003 谢谢