植物原生质体的分离与纯化PPT.ppt

实验9 植物原生质体的分离与纯化 实验目的： 2 了解原生质体在植物体细胞遗传学上的意义。 1 学习植物原生质体的分离和纯化技术； 实验原理： 植物原生质体即为去除了细胞壁的植物细胞。分离原生质体的基本要求是获得大量的有活力的原生质体。去除细胞壁有两种方法，机械法和酶法。其中酶法是一种温和、有效的方法，但是仅局限于具有初生细胞壁的组织。植物的细胞壁由纤维素、半纤维素、果胶质和少量的蛋白质和脂类组成的，通常使用纤维素酶和果胶酶的混合酶液来分离原生质体。 实验用品： 用具：尼龙过滤网（400目）、双层漏斗、吸管、离心管、显微镜、剪刀、镊子、载玻片、盖玻片等。 药品：纤维素酶、果胶酶、8%甘露醇盐溶液、20%蔗糖盐溶液等。 实验材料： 菠菜、油菜等。 实验步骤： 1 取材：选取充分伸展开的幼嫩叶片，冲洗干净。 3 酶解：去除下表皮的叶片剪成小块，铺于酶液中，充分接触酶液。25~30℃酶解1~1.5小时，期间可晃动培养皿1~2次。 4 纯化： 1）过滤：用双层漏斗将原生质体过滤到离心管中。 2）纯化-漂浮法：用比原生质体比重大的20%蔗糖盐溶液经过离心后原生质体漂浮在蔗糖溶液的表面。（还有沉降法） 2 去下表皮：用镊子将下表皮撕掉，让叶肉细胞暴露，注意不要损伤细胞。 过滤后的液体进行500rpm，3min离心，收集原生质体 弃上清，沉淀用 2 ml 8%甘露醇盐溶液轻轻悬浮 在一新离心管中加入6~8 ml的20%蔗糖盐溶液，将原生质体悬浮液轻轻环加在蔗糖盐溶液上面 1000rpm，3min离心，漂浮原生质体 原生质体在蔗糖溶液上面形成绿环，吸出原生质体置于另一离心管中 再加入8%甘露醇盐溶液进行洗涤2~3次 过 滤 前 的 酶 解 液