第三章：PCR技术及应用PPT.ppt

某些靶基因含量高的标本，如人的组织、细胞、毛发、血液、培养后的细菌和病毒等病原体等，DNA粗制品及总RNA即可作为扩增模板，但在具体的扩增时，可对标本进行适当的稀释，在不影响靶基因模板的扩增浓度下，降低标本中PCR抑制物的浓度，以利于靶基因的扩增。 * 常见的几种PCR 1、逆转录PCR（RT-PCR） 2、巢式PCR 3、RACE 4、反向PCR 5、定量PCR-- Real Time PCR 半定量PCR * 反向PCR (reverse PCR) 是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。 可对未知序列扩增后进行分析,如探索邻接已知DNA片段的序列；用于仅知部分序列的全长cDNA的克隆,扩增基因文库的插入DNA；建立基因组步移文库。 已知序列 未知序列 未知序列 * Real time--PCR 荧光定量PCR 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程中每一轮循环产物的累积数量，最后通过标准曲线对 未知模板进行定量分析的方法。 提供 PCR 扩增的瞬时信息 * Real-Time PCR 所用的荧光化学分为两种： 1.荧光染料：SYBR-Green 2.荧光探针：TaqMan * 1、在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，特异性掺入DNA双链发射荧光信号，而游离的染料分子无荧光信号，保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 * 2、 PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针序列与正向/反向引物之间的基因序列互补。 探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。 R = Reporter，Q = Quencher * PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解， * 使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 * Real-Time PCR 优点： 准确定量结果； 特异性更高：TaqMan probe 闭管操作，无需凝胶电泳，有效防止污染； 全自动化反应、数据收集和分析； 高通量, 96- and 384-well formats PCR技术 分子生物学检验技术 教师：刘莉娜 主要内容 PCR的反应原理、过程 PCR反应体系及条件 PCR特点 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶链式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。是一项DNA体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的DNA。 聚合酶链式反应 （PCR：Polymerase Chain Reaction) Kary B. Mullis PCR是由美国科学家穆利斯提出的一种 体外简化条件下模拟DNA体内复制的DNA 快速扩增的方法，此技术获得1993年诺贝 尔化学奖。 体内DNA的复制体系 DNA聚合酶（I II III） 拓扑异构酶 解旋酶类 SSB 引物 dNTP Mg2+ 5’ 3’ 一、PCR反应的原理和过程 72℃ 94℃ 55℃ PCR循环 变性 退火 延伸 （一）基本原理 变性、退火、延伸 PCR的指数扩增（2n） 引物 延伸 延伸 5’ 5’ 3’ 3’ 变性、退火 变性、退火 (二)反应过程 变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链分子作为反应的模板； 退火（复性）：温度降至40~60℃左右，引物能与模板 DNA单链互补配对结合； 延伸：72℃左右，DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新与模板DNA链互补的半保留复制链；重复循环变性--退火 --延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”而且这种新链又可成为下次循环的模 板。 一生二、二生四、四生万物 Taq P1 P2 二、PCR反应体系 dATP dTTP dGTP dCTP Mg2+ 模板：DNA 引物：P1 P2 DNA聚合酶：Taq 原料：dNTP 反应缓冲液 辅助因子：Mg2+ PCR反应体系成分 模板 （template） 引物（primer） dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 酶 （T