第六章 基因工程及其应用(克隆)10PPT.ppt

cDNA文库的组建： 基因重组 反转录酶 mRNA cDNA 两种文库的比较 基因组文库中，所包含的外源基因片段不仅含有可被转录和翻译的区域，还含有不能转录的序列。 Genomic libraries have introns . cDNA文库中的插入片段是由mRNA逆转录生成，可直接指导转录和翻译，能直接用于基因表达或调控方面的研究。 cDNA libraries have no introns . ４. 人工合成基因 artificial gene 用化学合成技术(DNA合成仪)合成DNA分子。 synthesizes DNA using chemical synthesis technology (synthesis instrument) 人工合成基因必需首先知道核苷酸序列及其他相关的基因信息。 artificial gene must firstly know its nucleophosphate sequences and its related information . 化学合成法获取目的基因 由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列 目的基因的获取 化学合成法 cDNA文库 基因组DNA文库 聚合酶链式反应 二、 载体选择Choices of cloning vectors Plasmid vecters Bacteriophage vectors Cosmids Eukaryotic virus vector 三、 目的基因与载体的体外重组 这种DNA重组是靠DNA内切酶和连接酶将外源DNA与载体共价连接的。 The joining, or 1igation, of DNA fragments is carried out by an enzyme known as DNA ligase 连接的位点位于载体的多克隆位点 (multiple cloning site, MCS)。The ligation site locates in MCS of vector. DNA ligation One of the most important steps in a cloning procedure. Covalently join the DNA molecules with the base-pairing cohesive ends, or blunt ends, if the 5’-ends have phosphate groups 几种常用的DNA分子连接方法 1、粘性末端连接法 cohesive end ligation when inserted DNA have identical cohesive ends with vector ,as identical cohesive ends can be easily linked together with the help of DNA ligase 常用. 连接效率高. common usage , high ligation efficiency Bam HⅠ切割反应 GGATCC CCTAGG T4 DNA连接酶 15oC GATCC G G CCTAG + 载体DNA用 Bam HⅠ切割 目的基因用Bam HⅠ切割 重组体 载体自连 目的基因自连 同一限制酶切位点连接 目 录 通常可利用碱性磷酸酶处理线性的载体分子以去除其5`端的磷酸基团，降低载体环化几率. Alkaline phosphatase Removes the phosphate groups from the 5’-ends of the vector DNA linearized by a single restriction enzyme to prevent the self-ligation of the vector DNA upon the followed ligation The use of alkaline phosphatase to prevent religation of vector molecules G -OH CTTAA -OH 用定向克隆方式，即对载体和插入片段均使用两种内切酶进行处理 directional cloning (both inserted DNA and vector are respectively digested by two restriction endonuclease ,so the exogenous DNA can be di