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高效液相色谱培训 江苏天瑞仪器股份有限公司 庞秀权 2010.8.16 内容 1 液相色谱简介 2 液相色谱仪的组成和原理和常见故障 3 液相色谱方法的建立 第一部分 液相色谱简介 HPLC的理论发展简况 色谱法的分离原理是：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。 色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（Tswett）在1906 年研究用碳酸钙分离植物色素时发现的，色谱法(Chromatography)因之得名。后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。 液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。高效液相色谱法(High performance Liquid Chromatography，HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于60 年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法(High Pressure Liquid Chromatography，HPLC)。又因分析速度快而称为高速液相色谱法(High Speed Liquid Chromatography，HSLP)。也称现代液相色谱。 茨维特的实验 2 HPLC的特点和优点 HPLC 有以下特点： 高压-压力可达150~300Kg/cm2。色谱柱每米降压为75 Kg/cm2 以上。 高速-流速为0.1~10.0 ml/min。 高效-可达5000 塔板每米。在一根柱中同时分离成份可达100 种。 高灵敏度-紫外检测器灵敏度可达0.01ng。同时消耗样品少。 HPLC 与经典液相色谱相比有以下优点： 速度快-通常分析一个样品在15~30 min，有些样品甚至在5 min 内即可完成。 分辨率高-可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。 灵敏度高-紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg。 柱子可反复使用-用一根色谱柱可分离不同的化合物。 样品量少，容易回收-样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。 3 液相色谱法的分类 按流动相的物态分: –气相色谱(Gas Chromatography, GC) 用气体作为流动相(又叫载气) –液相色谱(Liquid Chromatography, LC) 用液体作为流动相(又叫洗脱剂) 按固定相的形态分: –平面色谱 ??纸色谱 ??薄层色谱 –柱色谱 按流动相和固定相的相对极性分: –正相色谱(Normal Phase Chromatography) ??固定相的极性大于流动相 –反相色谱(Reversed Phase Chromatography) ??固定相的极性小于流动相 正相色谱法 采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。 反相色谱法 一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。RPC 在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC 应用的80%左右。 按分离过程的机理分: –吸附色谱(Absorption Chromatography) ??根据样品组分对活性固定相表面吸附亲和力的不同实现分离 –分配色谱(Partition Chromatography) ??分离基于样品组分在固定相和流动相中的溶解度(分配系数)不同 –离子交换色谱(Ion ExchangeChromatography) ??根据样品组份离子交换亲和力的差异分离,简称离子色谱(IC) –体积排除色谱(Size Exclusion Chromatography) ??GPC(Gel PermeationChromatography) –固定相是疏水性凝胶,流动相是有机溶剂 ??GFC(Gel Filtration Chromatography) –固定相是亲水性凝胶,流动相是水溶液 4 液相色谱常用术语 色谱图(Chromatogram): 色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图,其纵坐标为信号强度,横坐标为时间