PCR仪及凝胶成像系统.pptVIP

PCR仪和凝胶成像系统;内 容; 多聚酶链式反应 （PCR：Polymerase Chain Reaction);体内DNA的复制体系;Mullis的PCR构思;thermus aquaticus;PCR反应条件; PCR反应条件 变性 使双链DNA解链为单链 94℃， 20-30秒 (2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合; 降低温度可增加反应的灵敏性。 一般为45～65℃, 30秒;（3）延伸 70-75℃,一般为72℃ 延伸时间由扩增片段长度决定，1分钟扩增1Kbp （4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加;PCR的基本原理;PCR的基本原理小结; 实时荧光定量PCR仪;PCR示例;1.按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试剂 并混匀： 10 X PCR反应缓冲液 2.5 μL 25mmol/L MgCl2 2.0μL 10mmol/L dNTP 1.0 μL 10μmol/L 引物1 1.0 μL 10μmol/L引物2 1.0μL 质粒DNA 1.0 μL Taq 0.1 μL(5U) 水补充至 25.0 μL; ⑴94~96℃ 30’’-3’ 预变性（使模板充分变性） ⑵94℃ 30’’ 变性 ⑶45-65℃ 30’’-1’ 复性（使引物与模板充分退火） ⑷72℃ n’ 延伸 (按1’扩增1kb计算） ⑹72℃ 3-7’ 总的延伸（使产物延伸完整） ⑺4-10℃ 保存;3.反应完成后,将反应液与凝胶电泳缓冲液按比例混匀,上样电泳。;PCR?;以PCR为基础的相关技术;逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR);荧光定量PCR(FQ-PCR);多重PCR技术的难点在于其多对引物的设计，必需保证多对引物之间不形成引物二聚体，引物与目标模板区域具有高度特异性;原位PCR(In situ PCR)原位PCR是指在组织或细胞标本片上直接进行PCR，对细胞中的靶DNA进行扩增，通过掺入标记基团直接显色或结合原位杂交进行检测的方法。可分为直接法和间接法。基本步骤：组织切片或细胞固定→蛋白酶消化→原位PCR扩增→冲洗→产物检测优点：灵敏度高，可进行细胞内定位;锚定PCR(anchored PCR)： ?引进锚定引物，可以克服序列未知或序列未全知的障碍。 ?在DNA3’-末端加上poly(dG)尾，与此相对应的锚定引物poly(dC)一般应在十二聚以上。;;不对称PCR(asymmetric PCR) 不对称PCR主要是在PCR体系中设计不同的引物浓度，两条引物浓度比为1：50或1：100，前12个循环两条模板等量扩增，之后低浓度引物消耗殆尽，其扩增产物减少以至于无；而高浓度引物介导产生的扩增产物（即单链DNA）逐渐增加，可得到大量单链DNA（ssDNA）用于直接测序。;差别PCR (differential PCR)差别PCR是将靶基因与已知拷贝的参照基因置于同一PCR反应体系中，用同一套引物进行扩增，电泳染色后可根据参照基因的扩增产物与待测基因扩增产物的相对丰度对待测基因进行定量。;ChampChemi Basic系列全自动化学发光/荧光/可见光成像分析系统;可对各种化学发光、荧光、可见光图像进行拍摄和分析: ■ 核酸检测 各种荧光染料，如EB, SYBR Green ■ 蛋白检测 考马斯亮蓝胶，银染胶以及荧光染料如Sypro Red, Sypro Orange, Pro-Q Diamond, Deep Purple?标记胶/膜/芯片等； ■化学发光检测 Western Lightning, ECL, ECL plus, SuperSign