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实时PCR引物、探针设计 及软件使用 厦门大学分子诊断教育部工程研究中心 引物的重要性 上游引物 聚合酶 DNA模板 dNTPs 下游引物 PCR反应的效率和特异性取决于两个方 面： 引物与模板的特异结合 多聚酶对引物的有效延伸 引物的设计对于PCR 反应极为重要! ＋ 特异靶序列 非特异靶序列 特异杂交 非特异杂交 分子信标 分子信标 探针的重要性 ＋ 引物、探针设计 查找基因序列 序列分析 引物、探针设计 特异性验证 GenBank ClustalX Primer Premier 5.0 TM Utility v1.3 mfold BLAST 例:根据大肠杆菌rfbE基因序列， 设计引物和探针 1.检索大肠杆菌rfbE的基因序列 National Center for Biotechnology Information 美国国立生物技术信息中心 GenBank DNA序列数据库拥有来自 47,000个物种的30亿个碱基 在“Search”搜索框 中选择“Nucleotide” rfbE 检索结果中有很多无关菌，为查 找Ecoli.的rfbE基因带来麻烦 限制检索范围，将结果 锁定于待查目标 rfbE Escherichia coli 基因序列长度 蛋白产物名称 相应氨基酸序列 rfbE基因序列 以纯文本文件格式保存 clustalx 2.基因序列分析，确定同源序列 同源序列区域 序列比对结果 3. 引物与探针的设计 （1）引物的设计 序列朗读 限制性内切酶位点分析 主要功能介绍 DNA与蛋白序列的互换 引物设计 语音提示键盘输入 DNA基元查找 引物设计的基本原则 引物与模板序列要紧密互补 引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构 引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错 配） 引物的长度 一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38bp GC含量一般为40-60% 碱基的随机分布 引物中四种碱基最好随机分布，避免嘌呤、嘧啶堆积现象 避免引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC 引物的3’端 与目的位点必须完全同源 与非目的位点避免连续5-6bp的同源 引物设计的原则的原则 引物设计的原则 引物的Tm值 上下游引物的Tm值尽可能一致，Tm差异不应超过5°C 根据Tm值，确定退火温度 ∆G值：DNA双链形成所需要的自由能 3’端∆G 值较低，5’端和中间∆G 值相对较高 避免引物内部及引物之间二级结构的产生 引物自身：发夹结构、引物二聚体 引物之间：引物二聚体 引物的修饰 5’端序列常用来引进修饰位点或标记物 导入同源序列 PCR模板及引物位置 上下游引物的性质 引物的二级结构 尽可能选取不形成二级结构的引物 选取二级结构能值较低的引物 （4.5kcal/mol） 3. 引物与探针的设计 （2）探针的设计—分子信标 TM Utility v1.3 mfold 环 臂 分子信标—发夹结构 环：15-30nt,与靶序列互补的Tm比引 物Tm值高5～10 ℃，一般小于72 ℃ 臂：5-7bp, 富含GC 荧光基团一般不直接标记在G上：5’端 第一个碱基不为G 二级结构正确 分子信标设计的原则 序列保守 CCTCCG C ATCCAT GGAGGC A GATTAA 上游引物 下游引物 探针区 ATCCATCAAATTAGCGGAGG CCTCCGATCCATCAAATTAGCGGAGG |||||| CCTCCGATCCATCAAATTAGCGGAGG 分子信标的二级结构 /Blast.cgi 4.验证引物与探针的特异性 AGGTGAAGGTGGAATGGTNNNNNNNNNN CTGTACATAGGCAATATTGGNNNNNNNNN NCTTGTTCTAACTGGGCTAA 5’-AGGTGAAGGTGGAATGGT-3’ 5’-CTTGTTCTAACTGGGCTAA-3’ 5’- CTGTACATAGGCAATATTGG-3’ 更多信息…… DnaSP 4.50.3 SNPHunter 1.75 G-InforBIO V1.89 Oligo 7.0 Beacon Designer 7.5 TGGE-STAR AutoDimer 1.0 MutaPrimer 1.0 PCR Analyzer 1.0 Primer 3 The Primer Generator AutoPrimer 基因多态性分析软件 SNP（单核苷酸多态性）查找软件 基因组数据建库与分析软件 引物分析著名软件 荧光定量P