肾小管上皮细胞分离实验研究.docVIP

肾小管上皮细胞分离实验研究 　　目前大量关于肾的毒理学、药物测试等研究需要肾小管上皮细胞株。但是，细胞株部分基因的变异或缺失与正常细胞存在差异，原代细胞在表达正常细胞生理状态下则更显优势[1],因此寻求一种有效的肾小管上皮细胞的原代培养尤为重要。目前多篇文献[1-7]对肾小管上皮细胞的原代培养都有各自见解，本实验将其简化并加以改良，在文献的基础上[2]优化实验条件，寻找经济材料以及合适的浓度以获得大量良好的肾小管上皮细胞。在试验中发现将第一次细胞换取液可再次利用，仍有大量高纯度的肾小管上皮细胞贴壁且贴壁良好。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　实验动物：SD 大鼠，雄性，4~5 周龄（徐州医学院实验动物中心）；昆明小鼠，4~5 周龄（徐州医学院实验动物中心）。 　　1.2 主要试剂胎 牛 血 清（杭 州 四 季 青），DMEM-F12 1:1 培 养 基（Thermo），型胶原酶 （ 美国 Sigma），胰酶消化液，双抗（青霉素 - 链霉素溶液 100×），兔抗人角蛋白 CK18（Bioss），SABC免疫组化染色试剂盒（博士德生物），DAB 显色试剂盒（博士德生物）。 　　1.3 试验方法 　　1.3.1 肾小管节段分离 　　大鼠和小鼠实验前均禁食 12 小时，进水自由。脱臼处死，75% 乙醇中浸泡 5min.在超净台中取出肾，置于冷的含双抗的 PBS 溶液中，去除肾蒂和包膜，将肾皮质剪碎大小至1mm3,PBS 洗涤 3 次后，放置 80 目不锈钢筛网上，用 50ml灭菌注射器柄轻轻研磨，PBS 液充分清洗后的网下液转移至100 目不锈钢筛网中，将 100 目筛网倒置 PBS 冲洗取网上液。 　　取得的液体经 1500r/min 离心 8min,弃去上清液在沉淀中加入型胶原酶，分别 37振荡消化，振荡消化时间分三组，分别为 20min,25min,30min.双倍体积 DMEM-F12 培养基中和后，1500r/min 离心 8min. 　　1.3.2 肾小管上皮细胞的原代培养及传代 　　在 上 述 离 心 后 的 沉 淀 中 加 入 含 10% 胎 牛 血 清 的DMEM-F12 培养基，轻轻吹打混匀。接种到 25mL 培养瓶中。培养瓶静置于 37 5% 的 CO2培养箱中培养。24h 后补加培养基。72h 后首次换液。之后隔天换液。原代培养 4~6 天，细胞贴满瓶底，用胰蛋白酶消化并传代培养。 　　1.3.3 首次换液后废液的有效利用 　　72h 首次换液时，将废液至于新的培养瓶中，添加适当的培养基，静置于 37 5% 的 CO2 培养箱中培养。视细胞贴壁状态可于 48h 半换液，72h 全换液。 　　1.3.4 肾小管上皮细胞的鉴定1.3.4.1 倒置显微镜下对细胞的形态及生长进行观察1.3.4.2 免疫细胞化学法（SABC 法）细胞爬片后，PBS 轻轻冲洗。4% 多聚甲醛固定 60min. 　　吸去多聚甲醛后空气干燥 5min,加入 30%H2O2纯甲醇（1:50）混合液浸泡 30min,灭活内源性过氧化物酶，PBS 冲洗；加 5%BSA 封闭液，室温条件 20min,吸去多余液体；加兔抗人角蛋白 CK18（1:200），PBS 作为阴性对照。37下孵育 1h,PBS 洗涤 3 次。加入生物素化山羊抗兔 IgG（博士德生物）室温 20min,PBS 洗涤 3 次，加 SABC 37反应 20min,洗片，使用 DAB 试剂盒（AR1002）显色，苏木素轻度复染，中性树胶封片。 　　2 结果 　　2.1 SD 大鼠和昆明小鼠肾小管上皮细胞分离生长和传代的比较 　　SD 大鼠刚分离的以肾小管节段以及单个游离肾小管上皮细胞，在倒置显微镜下圆形透亮，体积较大，强折光性好。（ 图 1）12h 后部分细胞开始贴壁，以肾小管节段周围聚集密集。24h 后细胞大量贴壁且有少量上皮样细胞爬出，72h 细胞紧密衔接呈典型鹅卵石铺路样，折光性好。（图 2）SD 大鼠传代至第二代时开始有细胞漂浮，传代到第三代时大量凋亡。昆明小鼠刚分离的肾小管以肾小管节段居多，形态与大鼠相似。（图 3）贴壁速度比 SD 大鼠略慢，但生长速度快，培养 72h 已长满瓶底。（图 4）传代至第三代时依旧有大量细胞紧贴瓶底。 　　2.2 胶原蛋白不同时间的消化结果 　　SD 大鼠分离出的 100 目网上液，37环境下，胶原酶消化 20min 肾小管节段较多，于 36h 已开始贴壁，72h 后贴壁达45%,生长状态较好，纯度较高。细胞传代至第二代细胞活性降低，细胞开始凋亡漂浮。胶原酶消化 25min 肾小管节段以及游离细胞明显增多，24h 有部分细胞贴壁，原代培养 36-72 h 有上皮细胞从周边长出呈岛屿状，（图 5）细胞传代到第三代开始有少量细胞漂浮，生长缓