实验九 纳他霉素发酵生产.doc

实验九 纳他霉素的发酵生产、分离纯化及检测 实验目的： 通过摇瓶发酵生产纳他霉素，加深对好氧发酵过程中菌体生长与次级代谢产物积累的关系的认识，积累代谢调控发酵及相关产品分离纯化和分析检测的经验。 实验原理： 纳他霉素（Natamycin）是一种多烯大环内酯类抗真菌剂，也称游链霉素或匹马霉素(Pimaricin)。它是由5个多聚乙酰合成酶基因编码的多酶体系合成。由于它能够专性地抑制酵母菌和霉菌，被广泛应用于食品防腐和真菌引起的疾病的治疗。 纳他霉素的结构和性质 图8-1 纳他霉素的分子结构 纳他霉素是近白色至奶油黄色结晶粉末，几乎无臭无味，溶点280℃（分解），分子式C33H47O13，相对分子量665.75，结构式如图所示。纳他霉素是一类两性物质，分子中有一个碱性基团和一个酸性基团，等电点为6.5。 纳他霉素在水中和极性有机溶剂中溶解度很低，不溶于非极性溶剂，室温下在水中的溶解度为30～50mg/L。易于溶于碱性和酸性的水溶液中。转变为胆酸盐形式后溶解度可以迅速增加。纳他霉素的低水溶性不利于它的生物利用度。因为溶解的纳他霉素必须扩散到目标物的活性部位，并且和目标物结合才能发挥作用。 在大多数食品的pH值范围内，纳他霉素是非常稳定的。高温、紫外线、氧化剂及重金属等会影响纳他霉素低的稳定性。但可以瞬时高温（温度可达100℃）不影响其活性。N-Natamycin(3-N-dimethylaminopropylsuccimido)的活性比较低，可能是对它的化学修饰都会降低其活性，纳他霉素是经深层发酵和多步提取工艺精制而成，其制剂通常是50%纳他霉素和50%乳糖的混合物。 纳他霉素的生产菌种主要有Streptomyces chattanovgensis, Streptomyces natulonso, Streptomyces gilvosporeus等3种链霉菌。本实验所用菌种为褐黄孢链霉菌（Streptomyces gilvosporeus），孢子丝螺旋形。孢子表面带刺。 在发酵过程中，培养液中各成分的浓度和类型都会影响纳他霉素的生物合成，其中碳氮比是最关键的因素之一，氮源促进菌体的生长繁殖，同时要在发酵中流加补充适当的碳源(葡萄糖)。纳他霉素在以葡萄糖作为碳源时产量最高，这是因为葡萄糖能渗入纳他霉素的分子中去。有资料表明，氮源的类型对菌体生长和纳他霉素的产量有较大影响，菌体细胞生长最好的氮源是酵母抽提物，而纳他霉素产生的最佳氮源是牛肉浸出物。 纳他霉素的抑菌作用机制 纳他霉素是26种多烯烃大环内酯类抗真菌剂的一种，多烯是一平面大环内酯环状结构，纳他霉素分子的疏水部分即大环内酯的双键部分以范德华力和真菌细胞质膜上的甾醇分子结合，形成抗生素－甾醇复合物，破坏细胞质膜的渗透性；分子的亲水部分即大环内酯的多醇部分则在膜上形成水孔，损伤膜的通透性，从而引起菌内氨基酸、电解质等重要物质渗出而死亡。但有些微生物如细菌的细胞壁及细胞质膜不存在这些类甾醇化合物，所以纳他霉素对细菌没有作用。 药品及仪器设备 药品 酵母提取粉、麦芽提取粉、葡萄糖、琼脂、蛋白胨、氯化钠、大豆分离蛋白、麦芽糊精、酵母提取粉、乙醇、甲醇、20％NaOH、抗氧化剂BHA、1，2丙二醇、纳他霉素标准品 仪器设备 250ml三角瓶、摇床、生化培养箱、离心机、紫外分光光度计 操作步骤 孢子、种子液的制备和摇瓶发酵 菌种：褐黄孢链霉菌（Streptomyces gilvosporeus） 斜面孢子培养 孢子培养基 酵母提取粉 4g/L 麦芽提取粉 10 g/L 葡萄糖 4g/L 琼脂 20g/L pH7.0 孢子斜面制备 按斜面孢子培养基配方称好原料，用融化琼脂溶解，定容，用20％氢氧化钾调pH，121℃灭菌15分钟，摆斜面冷却后置于37℃培养1－2天，备用。用斜面转管接种，25℃培养10天，待孢子长满后，放置冰箱5天以上再用。 涂片观察孢子形态，并显微拍照。 摇瓶种子培养 摇瓶种子培养基共100ml，分装2瓶 葡萄糖 15g/L 蛋白胨 10g/L 氯化钠 10g/L pH7.0 摇瓶种子制备 按摇瓶种子培养基配方称好原料，用水溶解，定容，调pH，分装（250ml装50ml），121℃灭菌15分钟。待培养基冷却后，刮取孢子接种摇瓶，每支斜面接种5瓶摇瓶。，29℃，200rpm振荡培养24小时。无菌取样，涂片观察种子菌球形态，并显微拍照。 摇瓶发酵培养 摇瓶发酵培养基1000ml，分装6瓶 大豆分离蛋白 19.5g/L 麦芽糊精 50g/L 酵母提取粉 4g/L 葡萄糖 6g/L pH7.0 摇瓶发酵 按摇瓶发酵培养基配方称好原料，用水溶解，定容，调pH，分装（250mL装40mL），121℃灭菌25分钟。待培养基冷