基因工程操作的工具酶zxPPT课件.ppt

基因工程原理和技术; ;第2章 基因工程操作的工具酶;Date; 基因工程的操作，是在分子水平上的操作，是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶，DN聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割，拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“工具酶”。工具酶是对野生菌株（或真核生物如酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产品。 ;限制性内切酶—主要用于DNA分子的特异切割 DNA甲基化酶—用于DNA分子的甲基化 核酸酶—用于DNA和RNA的非特异性切割 核酸聚合酶—用于DNA和RNA的合成 核酸连接酶—用于DNA和RNA的连接 核酸末端修饰酶—用于DNA和RNA的末端修饰 其它酶类—用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等。;何谓限制性核酸内切酶？是如何发现的…….;限制性核酸内切酶 (restriction endonuelease)　 这类酶又简称为限制性内切酶或限制酶 。 　 是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶(endo-deoxyribonuclease)。 ;限制性内切酶的发现 限制性内切酶的分类 限制性内切酶的命名以及识别特点 Ⅱ型限制性内切酶的切割方式 Ⅱ型限制性内切酶的反应条件 影响限制性内切酶活性的因素;寄主控制的限制（restriction） 与修饰 (modification) 现象： 人们发现侵染大肠杆菌的噬菌体都存在着一些功能性障碍。即所谓的寄主控制的限制与修饰现象简称（R/M体系）。 细菌的R/M体系类似于免疫系统，能辨别自身的DNA与外来的DNA，并能使后者降解掉。 ;噬菌体侵染细菌; ? 细菌的限制—修饰作用;噬菌体侵染细菌; E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶 当λ(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。 EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。;寄主是由两种酶活性配合完成的 一种是修饰的甲基转移酶 另一种是核酸内切限制酶; R-M 系统是细菌安内御外的积极措施。细菌 R-M 系统的限制???可以降解外源 DNA，为避免自身 DNA 的降解，细菌可以修饰（甲基化酶）自身 DNA，未被修饰的外来 DNA 则会被降解。 个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予被降解。;　 限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源DNA的一类酶，其功能是避免外源DNA的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。;1968 Linn 和 Arber 从 E.coli B 中发现限制酶Ⅰ 1970 Smith（美）在流感嗜血杆菌发现限制酶Ⅱ 1978 W. Arber，H. O.Smith，Nathans 因发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献获得诺贝尔奖金 。;限制性核酸内切酶（限制酶）： 　　在细胞内能够识别双链 DNA 分子中的特定核苷酸序列，并对 DNA 分子进行切割的一种酶。 功能：降解不同源 DNA，而不降解同源 DNA。;根据酶的功能、大小和反应条件，及切割DNA的特点，可以将限制性内切酶分为三类： Ⅰ型酶、Ⅱ型酶、 Ⅲ型酶 ;Ⅰ型限制酶（无用） 1968年，M.Meselson和R.Yuan在E.coliB和E.coliK中分离出的核酸内切酶。 分子量：30万dal左右 组成：3种亚基 特异性亚基：具特异性识别DNA序列的特性。 修饰亚基：具甲基化酶活性。 限制亚基：具核酸内切酶活性。 辅助因子：需Mg2+、ATP和SAM。 识别和切割位点：不一致（距识别位点5’一侧数千碱基处随机切割DNA分子）。;Ⅱ型限制酶（十分有用） 1970年，H.O.Smith和K.W.Wilcox在流感嗜血Rd株中分离出来的限制酶。 分子量：2万～10万dal（较小） 组成：一种多肽，常以同源二聚体形式存在。 辅助因子：无需辅助因子，或只需Mg2+。 识别和切割位点：相一致。;Ⅲ型限制酶（无用） 组成：两个亚基 M亚基：负责位点的识别与修饰。 R亚基：具核酸酶的活性。 辅助因子：需Mg2+、ATP和SAM 识别和切割位点：不一致（距识别位点一侧约25bp处切割DNA分子）。;　　　　　　　　限制性核酸内切酶