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通过抑制消减杂交确定油菜胚组织中的不同的表达序列植物细胞组织器官培养（2006）86:417-421摘要：一个差减cDNA文库包含576个克隆它们的结构是彼此分离的表达在油菜的前胚组织中。通过不同的筛选，只有16种被鉴定是潜在的阳性。最后，只有3种BNPE DG3, BNPE AE4 和BNPE EG。在Northern分析中被确认上调在PEC油菜胚栽植。这是第一个研究报告关于Ae4, Dg3和Eg1顺序在油菜PEC的胚表达上并且联合胚体在油菜的再生胚组织中。Ae4编码了一个假定的富含脯氨酸蛋白质，Dg3编码脂质转移样蛋白和Eg1编码了napin，有很多数量BNMNAP子家族。关键词：再生胚胚胎能力 不同基因表达 SSH 甘蓝型油菜缩略语：SSH 抑制差减杂交NEC 无胚胎组织PEC 前胚组织BNPE甘蓝型前胚组织介绍：甘蓝型油菜再生胚组织中不需要荷尔蒙去刺激胚胎发育（源自1982年），经过一段时间的栽植已经形成了一个稳定的胚胎并且消除了前胚阶段。(Loh 1982; Namasivayamet al.2006).这个系统被用作分离和识别特异基因通过抑制差减杂交特别上调在前胚阶段。(Diatchenko et al. 1996)，无胚组织tissue (NEC) was used as a control被用作对照tissue against which to detect the up-regulation of组织，以此来检测上调genes in pre-embryogenic tissue (PEC).前在基因中的胚组织，无胚组织is hypocotyl tissue of seedlings grown from germinated是生长发芽seed (Loh1982) under the same experimental种子长成幼苗形成胚轴组织（洛 1982年 ）在相同的实验conditions as the embryogenic culture, and胚培养的条件下，并没有表达任何能力对于再生胚胎。甘蓝型油菜过磷酸钙的NEC和PEC，最初产生被用来描述Namasivayam等 (2006)。聚甲和mRNA的purified by using Promega PolyATract_mRNA纯化通过试剂盒吸收聚乙烯和信使核糖核酸。不同的生物细胞系和生物分子生物学，生物技术和生物分子的能力。分离系统kit和总的细胞RNA是通过Chomczynski和Sacchi 方法(1987).SSH文库构建根据制造商指示的PCR – 选择TM基因差减kit（Clontech公司）之前的SSH是利用 cDNA从PEC合成mRNA的测试和从NEC公司（控制）驱动程序加以丰富，这是在上调的基因甘蓝型油菜中正向消减试验测试基因被向量克隆到pCR_2.1-TOPO，和化学转化成Shot E.coli 十大活跃细胞。（Invitrogen公司 美国）。对于反向减法，减法杂交是执行NEC中的mRNA携带的cDNA组织作为一个“测试者”，和来自PEC中的mRNA携带的cDNA组织作为一个“司机”。SSH文库的建立导致孤立了576个白色克隆，甘蓝型油菜前胚（BNPE）的克隆，使BNPE通过PCR扩增嵌入在内。利用嵌入适配器处理剂去识别重组克隆并且决定被嵌入576个克隆的大小，36个克隆/采样通道没有明显PCR产物（未显示数据）。插入大小在540个保持克隆中分布0.1 kb和1.5 kb之间，最小尺寸插入大小是于最初的带有RsaI限制测试基因。之前的差减cDNA的可能仍然包括PEC和NEC公司双方共同的成绩单。这个潜在的问题通过合理的处理转变了Northern方法（Zegzouti等。1997年）去在油菜的前胚上调中选择更严格的克隆。它的完成是通过差异筛选Southern杂交的PCR扩增基因插入与BNPE克隆放射性标记着差减探针（PEC cDNA作为测试者）和探针反向差减为测试仪（NEC公司基因）。优先考虑的是BNPE克隆，杂种主要是前向差减，探针插入因为他们很可能是假定存在表达在PEC中。因此，16 BNPE被确定为潜在的阳性并且是有顺序被嵌入的。国家生物技术信息中心所接受的序列数据对比GenBank核酸和蛋白质数据库 ，使用基本局部比对搜索工具，以寻找匹配的序列。仅仅11克隆被发现有大量的相似性，已知的蛋白质序列，而其余的这些克隆不符合标准的确立，（见表1）。不匹配序列克隆中有核酸和蛋白质数据库被嵌入短的序列，变量在全长cDNA已知基因5￠ or 3￠ 末端。。为了进一步证实他们的表达模式，6个潜在的克隆，似乎有趣公认他们的身份。因为他们对于Northern分析来说是完全陌生的。Northern分析结果大多体现在表2，只有