酶工程 第十节 酶与现代生命科学PPT课件.pptVIP

第十一讲 酶与现代生命科学; 一、酶是分子生物学研究的重要工具 酶是分子生物学研究的重要工具。特别是限制性核酸内切酶的发现提供了特异剪切DNA的工具,促进了DNA重组技术诞生,推动了基因工程发展,成为分子生物学研究的不可缺少的工具. HindⅡ 的识别序列和切割位点 ↓ 5’ --- GTPy PU AC –- 3’ 3’ --- CAPU Py TG –- 5’ ↑; 限制性内切酶在基因工程中的应用 ? 基因工程（genetic engineering），也叫基因操作、遗传工程，或重组体DNA技术。它是根据人们预先设想，采用酶学的方法，将目的基因（所需要的基因）重组到一个适宜的载体上组成重组子，再将重组子转化到适当受体细胞中进行扩增表达，以达到改造生物细胞的目的的技术。 ? 基因工程的整个过程由工程菌（细胞）的设计构建和基因产物的生产两大部分组成???前者主要在实验室里进行，其单元操作过程如下： ;; 基因工程的单元操作过程如下： （1）从供体细胞中分离出基因组DNA，用限制性 核酸内切酶分别将外源DNA（包括外源基因或目的基因）和载体分子切开。 （2）用DNA连接酶将含有外源基因的DNA片段接到 载体分子上，形成DNA重组分子。 （3）借助于细胞转化手段将DNA重组分子导入受 体细胞中。 （4）短时间培养转化细胞，以扩增DNA重组分子 或使其整含到受体细胞的基因组中。 （5）筛选和鉴定转化细胞，获得使外源基因高 效稳定表达的基因工程菌或细胞。 ; 关于限制性内切酶 Restriction endonueleases 限制性核酸内切酶简称限制性内切酶，是一类能识别双链DNA中特定核苷酸序列并具有专一切割位点的脱氧核糖核酸水解酶。 主要存在于细菌、霉菌中，至今已分离到1000种以上，搞清识别序列的有300种以上。 ;Meselson和Yuan实验;? 实验表明，这种限制的本质是宿主细胞K12中存在有能使外来DNA(? ?CDNA)有限降解的核酸水解酶。 ? 此后，又进一步证实了大肠杆菌K12中的修饰体系即为甲基化酶，该酶修饰了? ? K12 DNA上的特异部位，使其不被限制体系的酶切割。 ;1965年阿尔伯首次从理论上提出了生物体内存在着一种具有切割基因功能的限制性内切酶。并于1968年成功分 离出I型限制性内切酶与修饰酶。证实在细菌内存在两种不同功能但又相关的酶。 1970年史密斯从流感噬血杆菌d株中分离出了II型限制性内切酶；同年内森斯使用该酶降解猕猴肿瘤病毒SV40的DNA，首次完 成了对基因的切割，排列了酶切图谱。从此成为分子克隆技术中不可缺少的工具酶，推动了基因工程的发展。 1978年，上述三人因对限制性内切酶的贡献获得诺贝尔奖。 ;阿尔伯(1929～) 瑞士微生物遗传学家 ; 限制性内切酶命名规则 限制酶的命名从其来源微生物的拉丁名中摘取，即由其属名的第一个字母(大写)与种名的第一、二两个字母(小写)组成酶的基本命名，若酶的产生菌有株系之分，则有4个或4个以上拉丁字母组成，其第四个字母之后表示株系。 如 EcoRI来源于Echerichia.coli RY13 BamHI来源于B.amyloliquefaciens;; 限制性内切酶分类 已发现的限制酶可以分为三类或称作三型：I、II、III型。他们在酶反应中所需要的辅因子和切割DNA的位点都不相同，而且酶蛋白分子的大小和组成上也有差别。; 类别;; 二、 II 型限制性内切酶的特性 ? II型限制酶的识别特异性 ? 回文识别序列 II型限制酶的识别序列大多是具有 双重对称结构性结构,或称回文序列 (Palindromic Sequence); ? 非典型回文识别序列; ? 非回文识别序列 也有些限制酶识别序列非回文结构，切割位 点在距识别序列5至13个bp处。; ; ? 识别序列的长度与剪切频率;? 限制酶的切割特异性和酶切片段的末端结构; ;;粘性末端; 有没有例外？ （1）相同的限制性内切酶不总是产生匹配的片段 A） 含多重识别序列的限制酶 如 Hind I