pcr电泳条带分析 临床检验仪器与技术试验指导(电泳 PCR).doc

pcr电泳条带分析 临床检验仪器与技术试验指导(电泳+PCR) 实验一PCR基因扩增 一、实验目的与要求 （1）掌握PCR反应的基本原理； （2）了解PCR的基本操作流程。 二、实验原理 聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种体外核酸扩增系统，其原理类似DNA分子的天然复制过程，是将在待扩增的DNA片段和与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n 倍。该技术已成为分子生物学中一种有助于DNA克隆及基因分析的必需工具。 PCR的工作程序实际上是一个在模板DNA、一对已知序列的寡核苷酸引物和四种脱氧核苷酸等存在的情况下，DNA聚合酶依赖的酶促合成反应。扩增的特异性取决于引物与模板DNA的结合。整个扩增过程分三步：变性，加热使模板DNA双链间的氢键断裂而形成两条单链；退火，突然降低温度后模板DNA引物按碱基配对原则互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度、结构简单等特点，主要的结合发生在引物与模板之间；延伸，在DNA聚合酶及镁离子等的存在条件下，从引物的3′端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新的DNA链。完成以上三步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量就增加一倍，新形成的DNA链又成为下一轮循环的模板。经过25～40个循环后，DNA 可扩增106～109倍。 1. 缓冲液： 10～50 mMTris- HCl (pH8.4)：维持Taq酶作用环境的偏碱性。 25～50 mMKCl：促进引物退火，gt;50 mM会抑制Taq酶的活性。 100μg / ml 牛血清白蛋白 (BSA)：对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作用，建议使用乙酰化的 BSA。明胶、Tween-20、二硫苏糖醇 (DTT) 也有类似作用。 2. dNTPs : dATP、dGTP、dCTP、dTTP——底物，dNTP的质量与浓度和 PCR扩增效率有密切关系。 0.02～0.2 mM，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等，如其中任何一种浓度不同于其它几种时，就会引起错配。 dNTPs可与Mg2+结合，应注意Mg2+浓度与dNTPs浓度之间的关系， Mg2+浓度比 dNTPs 浓度高0.2～2.5 mM。