STAT3SURVIVIN途径介导槲皮素调控胃癌细胞增殖与凋亡.docVIP

STAT3SURVIVIN途径介导槲皮素调控胃癌细胞增殖和凋亡 【摘要】 目的: 观察STAT3SURVIVIN途径在槲皮素调控胃癌细胞SGC7901增殖和凋亡中的作用. 方法 : 不同浓度的槲皮素及阳性对照组(AG490 40 μmol/L)作用细胞后,MTT法检测细胞毒作用;流式细胞术检测细胞凋亡;Real time RTPCR, Western Blotting检测stat3，survivin基因mRNA及蛋白的表达. 结果: 随作用时间延长和浓度增高，槲皮素对SGC7901细胞增殖的抑制作用增强. 48 h槲皮素40 μmol/L组与阳性对照组凋亡率相近. Stat3，survivin mRNA之间呈直线相关关系(r=0.697，P=0.002)，且pstat3和survivin蛋白也呈直线相关关系(r=0.748，P=0.003). 结论: 槲皮素可能通过调控STAT3SURVIVIN途径抑制胃癌SGC7901细胞增殖并诱导凋亡. 【关键词】 stat3基因 survivin基因 槲皮素 胃肿瘤 细胞增殖 细胞凋亡 信号转导通路 　　0引言 　　槲皮素(quercetin, Que, 3, 3′, 4′, 5′, 72五羟基黄酮)又称槲皮酮,为中药槲树皮的主要提取成分,具有广泛的药理活性，如抗炎、抗肿瘤等. Stat3，survivin是继bcl2之后相继发现的两个重要的凋亡抑制基因. 大量体内外 研究 表明抑制这两种基因的表达或功能可以抑制肿瘤细胞生长,促进凋亡［1-2］. 黄酮类抗肿瘤药槲皮素是否通过抑制STAT3SURVIVIN途径促使肿瘤细胞调亡， 目前 尚属未知. 我们施用槲皮素于胃癌SGC7901细胞,观察STAT3SURVIVIN途径在槲皮素调控胃癌细胞增殖和凋亡中的作用. 　　1材料和方法 　　1.1材料人中分化胃癌细胞株SGC7901,由兰州大学分子生物学教研室提供;干粉型RPMI1640,槲皮素,DMSO,AG490购自Sigma公司;胎牛血清购自杭州四季青公司;MTT购自Inventrogen公司;总RNA柱式提取试剂盒购自BBI公司;Real Time PCR试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司. Stat3上游引物: 5′CCAGTCAGTGACCAGGCAGAAG3′,下游引物: 5′GCACGTACTCCATCGCTGACA3′,扩增产物114 bp；survivin上游引物:5′AGGTCATCTCGGCTGTTCCTG3′,下游引物: 5′TCATCCTCACTGCGGCTGTC3′,扩增产物127 bp;内参照GAPDH上游引物:5′GTGCTTTGACAAATCCCATCTGA3′,下游引物:5′GTTACTGT CCCGGATCTTGTCCA3′,扩增产物138 bp,均由宝生物工程（大连）有限公司合成. 兔抗人stat3多克隆抗体购自Cell Signal公司;兔抗人survivin多克隆抗体购自Santa Cruz公司. 　　1.2方法 　　1.2.1细胞培养及MTT法检测细胞毒作用SGC7901细胞于含100 mL/L胎牛血清的RPMI1640培养基中培养, 37℃,50 mL/L CO2孵箱中贴壁生长, 2.5 g/L胰酶消化传代. 实验分为空白对照组,阴性对照组（0.5 mL/L DMSO），阳性对照组（AG490 40 μmol/L），槲皮素4个浓度组（20,40，80，160 μmol/L）. 取同一批次对数生长期细胞制成单细胞悬液,5×103/孔接种于96孔板,每组设4个复孔. 24 h细胞贴壁后,弃培养液,加200 μL/孔无血清培养基同步化24 h,再次吸弃培养液,加无血清培养基180 μL/孔及各组药物,使终体积为200 μL/孔,终浓度为所需值. 分别于加药后24,48,72 h测吸光度值A(λ=490 nm). 抑制率 计算 公式：细胞抑制率(%) =(1-A处理组/A对照组)×100%. 计算IC50值,选择3个浓度进行后续实验. 　　1.2.2流式细胞仪检测细胞凋亡实验分为阴性对照组、阳性对照组、槲皮素（40 μmol/L）组. 细胞以5×105/mL的浓度接种于50 mL培养瓶，每组3瓶. 处理步骤同上. 加药后48 h胰酶消化，收集细胞,离心（800 r/min，5 min）,弃上清,加PBS液至总体积为1.5 mL/管,上流式细胞仪（双染法）检测细胞凋亡. 　　1.2.3Real Time RTPCR检测stat3和survivin基因mRNA的表达实验分为阴性对照组、阳性对照组、槲皮素(20,40