第2章 大肠杆菌基因工程.pptVIP

一、大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 二、外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理 三、大肠杆菌基因工程菌的构建策略 四、基因工程菌的遗传不稳定性及其对策 五、利用重组大肠杆菌生产人胰岛素 蛋白酶抗性或缺陷型表达系统的构建 无论是在真核生物还是在原核细胞中，重组目的蛋白表达后都会面临被降解的命运，其稳定性甚至还不如半衰期较短的受体细胞内源性蛋白质。 在大多数情况下，重组目的蛋白的不稳定性可归结为对受体细胞蛋白酶系统的敏感性。然而越来越多的实验表明，重组目的蛋白在受体细胞内的半衰期可以通过蛋白序列的人工设计以及受体细胞的改造加以调整和控制。 实验结果表明，大多数不稳定的重组目的蛋白是被大肠杆菌中的蛋白酶La和Ti降解的，两者分别由lon和clp基因编码，其蛋白水解活性依赖于ATP。lon基因由热休克等环境压力激活，细胞内异常蛋白或重组异源蛋白的过量表达也可作为一种环境压力诱导lon基因的表达。lon-的大肠杆菌突变株可使原来半衰期较短的细菌调控蛋白（如SulA、RscA、lN）稳定性大增，因此被广泛用作外源基因高效表达的受体菌。 (1)蛋白酶缺陷型受体细胞的改造 lon基因缺陷的大肠杆菌受体（lon -）： 大肠杆菌中庞大的热休克蛋白家族对异常或异源蛋白的降解也有重要作用，其机理是胁迫异常或异源蛋白形成一种对蛋白酶识别和降解较有利的空间构象，从而提高异常或异源蛋白对蛋白酶的敏感性。热休克基因dnaK、dnaJ、groEL、grpE以及环境压力特异性s因子编码基因htpR的突变株均呈现出对异源蛋白降解作用的严重缺陷，特别是lon-htpR-的双缺陷株，非常适合高效表达各种不稳定的重组异源蛋白。 htpR基因缺陷的大肠杆菌受体（htpR -）： 大量的实验结果表明，在所有的极性氨基酸中，天门冬氨酸（Asp）的存在对提高蛋白质稳定性的效应最显著，而且Asp残基离C末端越近，蛋白质的稳定性就越大。更为重要的是，在多种结构和功能相互独立的蛋白质C末端引入Asp残基，都能显著地延长这些蛋白质的半衰期，因此具有普遍意义。 (3)抗蛋白酶的重组异源蛋白序列的设计 多肽链C末端氨基酸序列对稳定性的影响： 大量的实验结果同时表明，如果多肽链的N末端序列中含有较高比例的Ala、Asn、Cys、Gln、His，则蛋白质的稳定性显著改善。 相反，N末端含有Pro、Glu、Ser、Thr的真核生物蛋白质，在真核和原核细胞中的半衰期通常很短，尤其Pro-Glu-Ser-Thr序列（PEST序列），是胞内蛋白酶的超敏感区。 多肽链N末端氨基酸序列对稳定性的影响： 基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制 改善基因工程菌不稳定性的策略 基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制 （1）工程菌遗传不稳定性的表现形式 基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳定性， 这种不稳定性具有下列两种表现形式： 结构不稳定性 重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰，导致 其表观生物学功能的丧失 分配不稳定性 整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸（curing） （2）工程菌遗传不稳定性的产生机制 受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解 能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞 外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢 产生应激反应：关闭合成途径，启动降解程序 重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配 这是重组质粒逃逸的基本原因 受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排 （3）重组质粒的逃逸率 一部分细胞不再携带重组质粒，这些空载细胞数与总细胞数之比称为 当含有重组质粒的工程菌在非选择性条件下生长时，培养系统中 称为重组质粒的宏观逃逸率。重组质粒逃逸的原因有： 高温培养、表面活性剂（SDS）、药物（利福平）、染料（ 吖啶）促使重组质粒渗漏 受体细胞中的核酸酶降解重组质粒 重组质粒在受体细胞分裂时不均匀分配，细胞所含重组质粒 拷贝数的差异随着细胞分裂次数的增多而加剧 改善基因工程菌不稳定性的策略 （1）改进载体受体系统 以增大质粒稳定性为目的的构建方法包括： 将R1质粒上的parB基因引入表达型载体中，其表达产物可以 选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞 正确设置载体上的多克隆位点，禁止DNA片段插在稳定区内 将受体细胞的致死性基因安装在载体上，同时构建条件致死 性的相应受体系统，如大肠杆菌的ssb基因（DNA单链结合 蛋白编码基因 （2）施加选择压力 根据载体上的抗药性标记，向培养系统中添加相应的抗生素 药